Två aminosyrarester bestämmer 2-APB-känsligheten hos jonkanalerna TRPV3 och TRPV4

Resultat

Identifiering av mutationer som specifikt påverkar 2-APB-respondensen.

Vi undersökte ett mus TRPV3-mutantbibliotek som bestod av ≈14 000 cDNA-konstruktioner som i genomsnitt innehöll 2,5 mutationer per klon som genererades med hjälp av felkänslig PCR. Mutantkonstruktioner transfekterades till humana embryonala njurar (HEK293) och kalciumresponser framkallade av värme (42 °C), 25 μM 2-APB och 1,75 mM kamfer övervakades i en plattläsare med fluorescensavbildning (FLIPR). Vi har nyligen beskrivit identifieringen av rester som specifikt krävs för TRPV3 värmeaktivering (20). Här fokuserade vi på datasetet för 2-APB och kamfer för att identifiera rester som specifikt krävs för kemiska reaktioner.

Specifikt valde vi ut kloner som visade normala reaktioner för den ena kemikalien, men signifikant minskad aktivering av den andra (för urvalskriterier, se Metodik). Positiva kloner plockades ut, återväxte och fullständiga dosresponskurvor mot varje stimulus mättes och EC50-värden beräknades (se metoder). Sju mutantkloner bekräftades som specifikt 2-APB-bristfälliga och sekvenserades. Anmärkningsvärt nog innehöll alla 7 kloner mutationer i 1 av 2 rester. Den första, histidin (H) 426, finns i den cytoplasmatiska N-terminusregionen, mellan ankyrin- och transmembrandomänen. Vi identifierade 4 olika substitutioner av H426 i screeningen (tabell 1). Den andra, arginin (R) 696 finns inom C-terminal cytoplasmatisk TRP-box (IWRLQR), en konserverad domän i TRP-kanaler (2, 3). De tre mutationerna vid denna rest har samma närbesläktade arginin- till lysinsubstitution. Alla 7 mutationer orsakade allvarliga brister i 2-APB-svar, utan att påverka kamferresponsen (tabell 1). Även om några kamferbristande kloner också identifierades var de relativt sett mer subtila mutationer, som försköt EC50-värdena för kamfer ≈2 gånger eller mindre (data visas inte). Av denna anledning fokuserade vi denna studie på de 2 rester som orsakar specifikt >10-faldig 2-APB-brist.

Initial elektrofysiologisk karakterisering av TRPV3-H426- och TRPV3-R696-kanaler.

FLIPR är ett indirekt sätt att mäta jonkanalaktivitet. För att bekräfta våra FLIPR-resultat använde vi patch clamp-teknik och mätte helcellsströmmar av vildtypmus TRPV3, TRPV3-H426N och TRPV3-R696K när 2-APB (1 μM till 3 mM) eller kamfer (0,3 till 20 mM) applicerades individuellt i bad från låga till höga koncentrationer (fig. 1 och fig. S1). På ett koncentrationsberoende sätt aktiverade 2-APB strömmar i HEK293-celler transfekterade med TRPV3 av vildtyp med genomsnittliga EC50-värden på 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) och 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) vid +100 respektive -100 mV (fig. 1A; fig. S1A). 2-APB inducerade inte mätbara strömmar i HEK293-celler transfekterade med TRPV3-H426N upp till 100 μM. Koncentrationer av 2-APB som är mättande för TRPV3 av vildtyp (0,3 till 3 mM) kunde dock aktivera strömmar i denna mutant på ett koncentrationsberoende sätt (fig. 1A; fig. S1A). Följaktligen visade TRPV3-H426N en >10-faldig EC50-förskjutning av 2-APB-beroende aktivering, och svaret nådde aldrig mättnad. I parallella experiment aktiverade kamfer också strömmar i HEK293-celler transfekterade med TRPV3 av vildtyp på ett koncentrationsberoende sätt med EC50-värden på 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) och 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) vid +100 respektive -100 mV. Viktigt är att vildtyp-liknande reaktioner på kamfer observerades i HEK293-celler transfekterade med TRPV3-H426N , vilket bekräftar att kamferaktiveringen är oförändrad i denna mutant (Fig. 1A; Fig. S1B).

I patch-clamp-experiment med hela celler inducerade 2-APB också minimal TRPV3-R696K-aktivering. Vid +100 mV började 2-APB aktivera HEK293-celler som uttrycker denna muterade kanal vid ≈3 μM och nådde mättnad vid 30 μM, med en EC50 på 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Högre koncentrationer av 2-APB (>30 μM) framkallade en desensibiliserande ström med en ”off-response” efter tvätt av 2-APB, ett fenomen som beskrivs i detalj nedan. Vid -100 mV lyckades dock inte 2-APB aktivera R696K-muterade kanaler ens vid 1 mM (fig. 1B; fig. S1A). Det maximala 2-APB-svaret vid 1 mM vid -100 mV var -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), vilket är betydligt mindre (>10-faldigt) än för TRPV3-kanaler av vildtyp (-482,1 ± 69,2 pA/pF vid 300 μM, n = 17), vilket tyder på att det maximala kanalsvaret som framkallas av 2-APB är minskat i TRPV3-R696K-mutanten. Kamfer aktiverade dock liknande svar på TRPV3- och TRPV3-R696K-transfekterade HEK293-celler (fig. 1B; fig. S1B). Därför bekräftade de första elektrofysiologiska uppgifterna våra screeningresultat att TRPV3-H426N- och TRPV3-R696K-mutanter är bristfälliga när det gäller 2-APB-reaktivitet, utan att det påverkar den övergripande kanalfunktionen, vilket testades genom deras förmåga att reagera på kamfer.

Vi frågade oss därefter vilka sidokedjeegenskaper hos H426 och R696 som är avgörande för TRPV3-aktivering av 2-APB. Vi muterade individuellt positionerna 426 och 696 till alla andra aminosyror och mätte FLIPR-dosresponskurvor för både 2-APB och kamfer. Intressant nog hade alla H426-mutanter minskade 2-APB-svar med en kraftig (>10-faldig) ökning av EC50-värdena (tabell S1). De flesta mutanter hade normala kamferresponser med undantag för den helixbrytande prolin-substitutionen, som uppvisade en ≈2-faldig ökning av kamfer-EC50. Uppgifterna stämmer överens med resultatet av vår primära screening som identifierade 4 olika substitutioner som resulterar i 2-APB-brist i denna position. Mutantkanaler med aromatiska sidokedjor F, T och W reagerade inte på vare sig kamfer eller 2-APB. De flesta R696-mutanter visade dock minskade 2-APB-svar, men hade också minskade maximala kamferresponser (20 mM), vilket tyder på att dessa mutationer påverkar det övergripande kanaluttrycket eller funktionen (tabell S2). Detta resultat överensstämmer också med vårt första resultat från den primära screeningen, där endast lysinsubstitutionen identifierades som specifikt nödvändig för 2-APB vid denna rest. R696F visade också ett visst 2-APB-specifikt underskott, även om maximala kamferresponser påverkades något. Mutanterna R696D, R696G, R696N, R696P, R696S och R696T uppvisade inga signifikanta reaktioner på vare sig 2-APB eller kamfer jämfört med pcDNA-vektortransfekterade celler.

Spänningsberoende respons förblev intakt i 2-APB-mutanter.

Spänningsberoende har visats ha viktiga roller i TRP-kanalernas aktivering och gating (1, 10-12, 21). I avsaknad av kemiska stimulatorer (t.ex. kamfer eller 2-APB) aktiverade spänningssteg från -120 till +180 mV (20 mV-steg) inte strömmar i HEK293-celler transfekterade med TRPV3 av vildtyp, vilket tyder på att TRPV3 (till skillnad från TRPV1 och TRPM8) inte aktiveras av enbart spänning vid det intervall som testats här (20, 22). I närvaro av 30 μM 2-APB aktiverades dock en spänningsberoende ström (fig. S2A). Som förväntat sågs ingen detekterbar spänningsmodulerad ström i TRPV3-H426N vid behandling med 30 μM 2-APB (fig. S2B). 6 mM kamfer framkallade dock en spänningsberoende ström i HEK293-celler som uttrycker TRPV3 av vildtyp (V1/2 på 81,3 ± 2,6 mV) (fig. S2 A och D) och TRPV3-H426N (V1/2 på 81,3 ± 2,5 mV) (fig. S2 B och D). I likhet med TRPVV3-H426N fanns det ingen påvisbar spänningsmodulerad ström i TRPV3-R696K när den behandlades med 30 μM 2-APB (fig. S2C). Kamfer aktiverade dock en spänningsberoende ström med en V1/2 på 81,1 ± 5,4 mV (fig. S2 C och D). Dessa resultat tyder på att spänningsmodulering är intakt i TRPV3-H426N och TRPV3-R696K och innebär att förlust av spänningsberoende sannolikt inte är orsaken till minskade reaktioner på 2-APB i dessa mutantkanaler.

Temperaturkänslighet hos TRPV3-H426N och TRPV3-R696K.

Temperaturkänslighet är ett kännetecken för TRPV3-kanalens funktion (14, 16, 23). Därför frågade vi om temperaturaktiveringen var förändrad i TRPV3-H426N- och TRPV3-R696K-kloner. Vi mätte temperaturaktivering (25 till 42 °C) av HEK293-celler som transfekterats med TRPV3 av vildtyp, TRPV3-H426N eller TRPV3-R696K-mutanten i en FLIPR-analys. Värmesvar av TRPV3-H426N var antingen lika med eller något större än vildtyp TRPV3-svar (n = 4 experiment), vilket tyder på att 2-APB- och värmeaktivering kan skiljas åt (fig. S2E; och data visas inte). Värmesvar i TRPV3-R696K var dock mycket mindre jämfört med vildtypen (n = 3 experiment), vilket tyder på att denna mutant inte specifikt förändrar 2-APB-aktiveringen (Fig. S2E).

Kalciumberoende desensibilisering av TRPV3-R696K.

En intressant egenskap hos 2-APB-svaret i TRPV3-R696K-transfekterade HEK293-celler är snabb desensibilisering vid >30 μM 2-APB och en avstängning av svaret på 2-APB vid höga koncentrationer (Fig. S3). Detta fenomen står i kontrast till TRPV3 av vildtyp, som sensibiliseras som svar på repetitiv/kontinuerlig stimulering av kemikalier eller värme (14, 16). Den mekanism som ligger till grund för TRPVV3-sensitisering föreslås vara en förlust av kalciumhämning av denna kanal (22). Eftersom desensibilisering av de flesta andra TRP-kanaler (t.ex. TRPV1 och TRPA1) mot kemiska eller temperaturstimuli också är beroende av extracellulärt kalcium (24, 25), satte vi oss för att testa om extracellulärt kalcium har en roll i 2-APB-väckta desensibiliseringsreaktioner i TRVP3-R696K. Överraskande nog aktiverade 100 μM 2-APB i avsaknad av extracelullärt kalcium en robust, vildtypisk inkommande och utgående strömmar i TRPV3-R696K (strömtäthet för TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF vid +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF vid -100 mV (n = 5); TRPV3 av vildtyp: 615,0 ± 266,7 pA/pF vid +100 mV och -471,0 ± 83,2 pA/pF vid -100 mV, n = 9) (fig. S4 A och B). Detta resultat tyder på att ersättning av ett arginin med ett lysin vid position 696 i TRP-boxen hos TRPV3 driver kanalen in i ett desensibiliserande tillstånd vid 2-APB- men inte kamfer-stimulering på ett kalciumberoende sätt. En förmodad Ca2+-bindande rest i porloopdomänen, aspartat 641, är bevarad bland alla TRPV-kanaler och är avgörande för TRP-kanalernas permeationsegenskaper (26, 27). Mutation av D641 till asparagin (N) har visat sig minska rutheniumröd blockering och extracelullär kalciumhämning med hög affinitet av TRPV3 och andra TRP-kanaler (17, 22, 26, 27). Därför undersökte vi om D641N-mutationen kunde lindra TRPV3-R696K-klonen från kalciumberoende förlust av 2-APB-svaret. I en FLIPR-analys hade TRPV3-D641N en EC50 på 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), vilket är ungefär hälften av värdet för TRPV3 av vildtyp (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Dubbelmutanten TRVP3-D641N/R696K hade en EC50 på 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), vilket visar att D641N-mutationen helt återställde 2-APB-svaret hos TRPV3-R696K. Som förväntat var kamferresponsen likartad bland TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N och TRPV3-D641N/R696K (fig. S4 C och D). Dessa studier visar att TRPV3-R696 inte enbart är en 2-APB-mutation. De observerade underskotten är kalciummedierade och påverkar 2-APB- men inte kamferresponsen.

2-APB-känsligheten i TRPV3-ortologer.

Aminosyrakonserveringar och variationer bland ortologer är användbara verktyg för att dissekera struktur-funktionsrelationer hos proteiner, inklusive TRP-kanaler (28, 29). Därför frågade vi om dessa TRPV3-ortologer har jämförbara kamfer- och 2-APB-svar. Faktum är att mänskliga, hund- och grod-TRPV3-kanaler, som har histidiner vid musekvivalent position 426 (fig. 2A), har liknande 2-APB-svar när de överuttrycks i HEK293-celler (även om kamferresponsen i Xenopus tropicalis TRPV3 minskade jämfört med vildtypen av musetRPV3) (fig. 2C). Som förväntat, när H426 hos människa, hund och groda muterades till N, försköts 2-APB-koncentrationsresponskurvorna kraftigt åt höger i var och en av dessa TRPV3-ortologer (Fig. 2B). Inte heller denna mutation minskade kamferkänsligheten jämfört med TRPV3-ortologer av vildtyp (fig. 2C). Tvärtom hade både mänskliga och grodda TRPV3 H426N-mutanter något högre kamferkänslighet än sina motsvarigheter av vildtyp. Dessa resultat tyder på att 2-APB-aktiveringsmekanismen för TRPV3 kan vara bevarad i olika arter.

Interessant är att även om R696 är bevarad i TRP-boxen i TRPV3 bland alla arter är den position som motsvarar mus 426 i kyckling TRPV3 (cTRPV3) ett N (427). Som visats ovan stör en H-N-substitution vid rest 426 i däggdjurs- eller amfibiearter de korrekta 2-APB-svaren (fig. 2A). I överensstämmelse med att denna rest är viktig för 2-APB-svar är EC50 för 2-APB i cTRPV3 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) jämfört med 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) för mus TRPV3. Det är slående att mutera N427 till H försköt koncentrationssvarskurvan för 2-APB betydligt åt vänster (EC50 på 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), medan EC50-värdet för kamfer förblev oförändrat (fig. 3A). Helcells patch clamp-inspelning bekräftade att 2-APB-koncentrationsresponskurvan var kraftigt förskjuten åt vänster i kyckling TRPV3-N427H jämfört med cTRPV3 av vildtyp vid både +100 och -100 mV (fig. 3B). Enskilda kanalregistreringar avslöjade en nästan 200-faldig ökning av kanalöppningar jämfört med basalnivån vid 25 μM 2-APB i inside-out patches från cTRPV3-N427H-uttryckande celler (n = 7), medan inga signifikanta förändringar observerades i inside-out patches från HEK293-celler av vildtyp cTRPV3-uttryckande HEK293-celler (n = 5). 6 mM kamfer ökade dock kraftigt öppningarna av enstaka kanaler i inifrån och ut-plaster från HEK293-celler som transfekterats med antingen cTRPV3 av vildtyp eller cTRPV3-N427H-mutanten på liknande nivåer (fig. 3 C-E). Därför ökar en enda punktmutation i kyckling TRPV3 specifikt dess känslighet för 2-APB.