U.S. Food and Drug Administration

Juli 2000

Toxikologiska principer för säkerhetsbedömning av livsmedelsingredienserRedbook 2000Kapitel IV.C.1.d. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test

Tillbaka till innehållsförteckningen i Redbook 2000

I. Introduktion

Mikronukleer är cytoplasmatiska kromatininnehållande kroppar som bildas när acentriska kromosomfragment eller kromosomer släpar efter under anafasen och misslyckas med att inkorporeras i dottercellkärnor under celldelningen. Eftersom genetiska skador som resulterar i kromosomavbrott, strukturellt onormala kromosomer eller spindelavvikelser leder till mikronukleusbildning, tjänar förekomsten av mikronukleus som ett index för dessa typer av skador. Det har fastställts att i princip alla ämnen som orsakar dubbelsträngade kromosombrott (klastogener) ger upphov till mikrokärnor. Eftersom räkningen av mikrokärnor är mycket snabbare och mindre tekniskt krävande än poängsättning av kromosomavvikelser, och eftersom mikrokärnor uppstår från två viktiga typer av genetiska skador (klastogenes och spindelavbrott), har mikrokärneanalysen använts i stor utsträckning för att screena för kemikalier som orsakar dessa typer av skador.

Denna vägledning behandlar den mest använda in vivo-mikronkärneanalysen: däggdjurs erytrocytmikronkärneanalys. Detta in vivo mikronukleustest används för att upptäcka skador som orsakas av testsubstansen på kromosomerna eller den mitotiska apparaten hos erytroblaster genom analys av erytrocyter från benmärg och/eller perifera blodceller från djur, vanligen gnagare.

Syftet med mikronukleustestet är att identifiera substanser som orsakar cytogenetiska skador som resulterar i bildandet av mikronukleier som innehåller eftersläpande kromosomfragment eller hela kromosomer.

När en erytroblast i benmärgen utvecklas till en polykromatisk erytrocyt, utvinns huvudkärnan; de mikronukleier som har bildats kan stanna kvar i den i övrigt enukleerade cytoplasman. Visualisering av mikrokärnor underlättas i dessa celler med hjälp av specifika färgningstekniker och eftersom de saknar en huvudkärna. En ökning av frekvensen av mikronukleerade polykromatiska erytrocyter hos behandlade djur är en indikation på inducerad kromosomskada.

II. Definitioner

Centromer (Kinetochore) är en region(er) på en kromosom som spindelfibrerna är associerade med under celldelningen, vilket möjliggör en ordnad förflyttning av dotterkromosomerna till dottercellernas poler.

Mikronkärnor är små kärnor som är skilda från och tillkommer till cellernas huvudkärnor och som bildas under telofasen i mitos (meios) av eftersläpande kromosomfragment eller hela kromosomer.

Normokromatisk erytrocyt är en mogen erytrocyt som saknar ribosomer och kan särskiljas från omogna, polykromatiska erytrocyter genom färgning som är selektiv för ribosomer.

Polykromatisk erytrocyt är en omogen erytrocyt, i ett mellanliggande utvecklingsstadium, som fortfarande innehåller ribosomer och därför kan särskiljas från mogna, normokromatiska erytrocyter med hjälp av färgningar som är selektiva för ribosomer.

III. Inledande överväganden

Benmärg från gnagare används rutinmässigt i detta test eftersom polykromatiska erytrocyter produceras i denna vävnad. Mätning av mikronukleerade omogna (polykromatiska) erytrocyter i perifert blod är lika godtagbart hos alla arter där mjältens oförmåga att avlägsna mikronukleerade erytrocyter har påvisats, eller som har visat sig vara tillräckligt känsliga för att upptäcka agens som orsakar strukturella och/eller numeriska kromosomavvikelser. Mikronukleier kan särskiljas med hjälp av ett antal kriterier. Dessa omfattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetokor eller centromeriskt DNA i mikronukleerna. Frekvensen av mikronukleerade omogna (polykromatiska) erytrocyter är den viktigaste mätpunkten. Antalet mogna (normokromatiska) erytrocyter i det perifera blodet som innehåller mikrokärnor bland ett givet antal mogna erytrocyter kan också användas som slutpunkt för analysen när djuren behandlas kontinuerligt under en period som överstiger erytrocytens livslängd hos den aktuella arten (t.ex. 4 veckor hos musen), under förutsättning att det inte sker någon signifikant selektion i mjälten mot mikrokärnavbildade erytrocyter hos den arten/stammen. Konsekvenserna av selektion i mjälten, om sådan sker, bör behandlas fullt ut.

Detta mikronukleustest in vivo för däggdjur är särskilt relevant för bedömning av mutagena risker eftersom det gör det möjligt att ta hänsyn till faktorer som rör metabolism in vivo, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser, även om dessa kan variera mellan olika arter, mellan olika vävnader och mellan olika genetiska endpoints. Ett in vivo-test är också användbart för ytterligare undersökning av en mutagen effekt som upptäckts av ett in vitro-system.

Om det finns belägg för att testsubstansen eller en reaktiv metabolit inte kommer att nå målvävnaden är det inte lämpligt att använda detta test.

IV. Testmetodens princip

Djur exponeras för testsubstansen på lämplig väg. Om benmärg används offras djuren vid lämpliga tidpunkter efter behandlingen, benmärgen extraheras och preparat framställs och färgas.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Om perifert blod används, tas blodet ut vid lämpliga tidpunkter efter behandlingen och preparat av smet görs och färgas.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Preparat analyseras med avseende på förekomst av mikrokärnor.

V. Beskrivning av metoden

A. Preparat

1. Val av djurarter

Historiskt sett har möss eller råttor använts rutinmässigt för denna analys. Om benmärg är den vävnad som provtas kan alla lämpliga däggdjursarter användas (se avsnitt III ovan). Som i alla toxikologiska undersökningar bör valet av lämplig art motiveras. När perifert blod används rekommenderas möss. Alla lämpliga däggdjursarter kan dock användas under förutsättning att det är en art där mjälten inte avlägsnar mikronukleerade erytrocyter eller att det är en art som har visat sig vara tillräckligt känslig för att upptäcka agens som orsakar strukturella och/eller numeriska kromosomavvikelser. Vanligt förekommande laboratoriestammar av unga friska djur bör användas. När studien inleds bör djurens viktvariation vara minimal och inte överstiga ±20 % av medelvikten för varje kön.

2. Förhållanden för inhysning och utfodring

Temperaturen i försöksdjursrummet bör vara lämplig för de arter som används; för möss och råttor bör den vara 22 °C (±3 °C). Även om den relativa luftfuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 % annat än vid rengöring av rummet, bör målet vara 50-60 %. Belysningen bör vara artificiell, med ordningen 12 timmars ljus och 12 timmars mörker. För utfodring kan konventionella laboratoriedieter användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig inblandning av en testsubstans när den administreras på detta sätt. Djuren kan hållas individuellt eller i burar i små grupper av samma kön.

3. Förberedelse av djuren

Sunda unga vuxna djur ska slumpmässigt fördelas till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska identifieras unikt. Djuren bör acklimatiseras till laboratorieförhållandena i minst fem dagar. Burarna bör arrangeras på ett sådant sätt att eventuella effekter på grund av burarnas placering minimeras.

4. Beredning av doser

Fasta testsubstanser bör lösas upp eller suspenderas i lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om det är lämpligt, innan djuren doseras. Flytande testsubstanser kan doseras direkt eller spädas före dosering. Färska beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.

B. Testförhållanden

1. Lösningsmedel/fordon

Lösningsmedlet/fordonet får inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och får inte misstänkas för kemisk reaktion med testsubstansen. Om andra än vanligt förekommande lösningsmedel/vehiklar används, bör användningen av dem stödjas av referensdata som visar att de är kompatibla med testämnet och djuren. Det rekommenderas att man vid behov först överväger att använda ett vattenhaltigt lösningsmedel/vehikel.

2. Kontroller

Samma positiva och negativa (lösningsmedel/vehikel) kontroller bör i allmänhet ingå för varje kön i varje test som utförs på gnagare. När mikronukleustestet utförs som en del av en allmän toxicitetsstudie i enlighet med GLP-riktlinjerna kommer dock verifiering av lämplig dosering att ske genom kemisk analys. I sådana fall kanske det inte är nödvändigt att samtidigt behandla djuren med ett positivt kontrollmedel, och kontroll av färgning och poängsättning kan ske genom att inkludera lämpliga referensprover som tidigare erhållits från djur som inte ingår i det aktuella försöket. I studier med högre arter, t.ex. primater eller hundar, kan positiva kontroller utelämnas under förutsättning att testlaboratoriet tidigare har visat att det finns ett godtagbart svar på positiva kontrollsubstanser hos den använda arten. I samtliga fall är samtidiga negativa kontroller en obligatorisk del av studien. Med undantag för behandling med testsubstansen ska djuren i kontrollgrupperna hanteras på samma sätt som djuren i behandlingsgrupperna.

Positiva kontroller ska producera mikrokärnor in vivo vid exponeringsnivåer som förväntas ge en påvisbar, statistiskt signifikant ökning jämfört med bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas så att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade objektglasen för läsaren. Det är godtagbart att den positiva kontrollen administreras på ett annat sätt än testämnet och att prover tas vid endast en enda tidpunkt. Dessutom kan man överväga att använda kemikalier för positiv kontroll som är relaterade till den kemiska klassen, om de finns tillgängliga. Exempel på positiva kontrollsubstanser är följande:

Negativa kontrolldjur, som behandlas med enbart lösningsmedel eller vehikel och i övrigt behandlas på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör ingå vid varje provtagningstillfälle, med undantag för att det under lämpliga omständigheter kan vara möjligt att använda ett djur som sin egen kontroll genom att jämföra proverna före och efter behandlingen. Om enstaka provtagning används för negativa kontroller bör den valda provtagningstiden motiveras. Dessutom bör obehandlade kontroller också användas om det inte finns a) uppgifter tillgängliga från testlaboratoriet eller b) historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/fordonet.

Om perifert blod används kan ett prov före behandling också vara godtagbart som en samtidig negativ kontroll, men endast i de korta studierna av perifert blod (t.ex, 1-3 behandling(ar)) när de resulterande uppgifterna ligger inom det förväntade intervallet för den historiska kontrollen och när frånvaron av en lösningsmedelseffekt har påvisats.

VI. Förfarande för råttor och möss

Följande avsnitt ger vägledning för förfaranden för möss och råttor, de arter som oftast används i denna test.

A. Antal djur och djurens kön

Varje behandlad grupp och kontrollgrupp bör innehålla minst 5 analysbara djur per kön.(12) Om det vid tidpunkten för studien finns tillgängliga data från studier på samma art och med samma exponeringsväg som visar att det inte finns några väsentliga skillnader mellan könen när det gäller toxicitet, räcker det med testning på ett enda kön.

B. Behandlingsschema

Flera olika behandlingsscheman (dvs. 1, 2 eller flera behandlingar med 24 timmars mellanrum) kan rekommenderas. Prover från behandlingar med förlängd dos är godtagbara så länge som en positiv effekt har påvisats för denna studie eller, för en negativ studie, så länge som toxicitet har påvisats eller gränsdosen (se avsnitt ”D” nedan) har använts och doseringen har fortsatt fram till provtagningstillfället. Detta grundar sig på studier som visar att upprepad exponering av möss och råttor under upp till subkronisk tid ger effekter av samma storleksordning som de som erhålls med den traditionella akuta analysen.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Eftersom det finns en viss oro för att känsligheten kan minska i studier på längre sikt på grund av att man inte lyckas uppnå en verklig MTD, eller på grund av att det kan förekomma en anpassning, anser man för närvarande att behandlingen under en längre tid bör begränsas till fyra veckor tills testets känslighet bekräftas när längre behandlingar används.(12)

Testsubstanser kan också administreras som en delad dos, dvs, två eller flera behandlingar på samma dag med högst några timmars mellanrum, för att underlätta administrering av en stor volym material eller för att minimera fluktuationer i blodnivåerna av testartikeln.

Två sätt på vilka testet kan utföras är:

• Djuren behandlas med testämnet en eller två gånger med ett intervall på högst 24 timmar. Prover av benmärg tas minst två gånger mellan 24 och 48 timmar efter den sista dosen, med lämpliga intervall mellan proverna. Det bör motiveras om provtagning sker tidigare än 24 timmar efter behandlingen. Prover från perifert blod tas minst två gånger mellan 36 och 72 timmar efter den sista behandlingen, med lämpligt intervall mellan proverna. När ett positivt svar konstateras vid ett provtagningstillfälle krävs ingen ytterligare provtagning.
• Om tre eller fler dagliga behandlingar används (t.ex. tre eller fler behandlingar med 24 timmars mellanrum) kan prover samlas in en gång senast 24 timmar efter den sista behandlingen av benmärgen och en gång senast 40 timmar efter den sista behandlingen av det perifera blodet.(12), (20)

Andra tidpunkter för provtagning kan användas när det är relevant och vetenskapligt motiverat.

C. Dosnivåer

Om en studie för att hitta ett dosintervall utförs på grund av att det inte finns några lämpliga data att tillgå, ska den utföras i samma laboratorium, med samma art, stam, kön och behandlingsschema som ska användas i huvudstudien.(7) Om det finns toxicitet ska tre dosnivåer användas för den första provtagningstiden. Dessa dosnivåer bör täcka ett intervall från tydlig toxicitet till liten eller ingen toxicitet. Vid den senare provtagningstillfället behöver endast den högsta dosen användas. Den högsta dosen definieras som den dos som ger sådana tecken på toxicitet att högre dosnivåer, baserade på samma doseringsschema, skulle förväntas ge dödlighet. Ämnen med specifika biologiska aktiviteter vid låga icke-toxiska doser (t.ex. hormoner och mitogener) kan utgöra undantag från doseringskriterierna och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan också definieras som en dos som ger någon indikation på toxicitet för benmärgen (t.ex. en minskning av andelen omogna erytrocyter bland de totala erytrocyterna i benmärgen eller det perifera blodet).

D. Gränstest

Om inga observerbara toxiska effekter uppstår vid en enda behandling med en dosnivå på minst 2000 mg/kg kroppsvikt, eller vid två behandlingar samma dag, och om genotoxicitet inte kan förväntas baserat på data från strukturellt besläktade ämnen, kan en fullständig studie med tre dosnivåer vara onödig. För studier av längre varaktighet är gränsdosen 2000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandling upp till 14 dagar och 1000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandling längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan indikera att det är nödvändigt att använda en högre dosnivå i gränsförsöket.

E. Administrering av doser

Testsubstansen administreras vanligen genom sondmatning med hjälp av en magsond eller en lämplig intubationskanyl, eller genom intraperitoneal injektion. Andra exponeringsvägar kan vara acceptabla om de kan motiveras. Den maximala vätskemängd som kan administreras genom gavage eller injektion vid ett och samma tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av större volymer måste motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen, som normalt kommer att avslöja förvärrade effekter med högre koncentrationer, bör variabiliteten i testvolymen minimeras genom att justera koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer.

F. Beredning av benmärg/blod

Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet omedelbart efter avlivning. Vanligtvis avlägsnas cellerna från lårbenet eller skenbenet, prepareras och färgas enligt etablerade metoder. Perifert blod tas från svansvenen eller annat lämpligt blodkärl. Blodcellerna färgas omedelbart supravitalt(4),(5),(14) eller så görs preparat som sedan färgas. Användning av en DNA-specifik färgning (t.ex. acridinorange(15) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y(30)) kan eliminera en del av de artefakter som är förknippade med användning av en icke-DNA-specifik färgning. Denna fördel utesluter inte användningen av konventionella färgningar (t.ex. Giemsa). Ytterligare system (t.ex, cellulosakolonner för att avlägsna cellkärnor(36)) kan också användas under förutsättning att dessa system har visat sig fungera tillfredsställande för mikronukleuspreparering i laboratoriet.

G. Analys

Andelen omogna bland de totala (omogna + mogna) erytrocyterna bestäms för varje djur genom att räkna sammanlagt minst 200 erytrocyter för benmärg och 1 000 erytrocyter för perifert blod. 9 Alla objektglas, även de för positiva och negativa kontroller, ska kodas oberoende av varandra före den mikroskopiska analysen. Minst 2000 omogna erytrocyter per djur poängsätts för förekomsten av mikronukleerade omogna erytrocyter. Ytterligare information kan erhållas genom att man bedömer mogna erytrocyter med avseende på mikrokärnor. Vid analys av objektglas bör andelen omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter inte vara mindre än 20 % av kontrollvärdet. När djuren behandlas kontinuerligt i 4 veckor eller mer kan minst 2 000 mogna erytrocyter per djur också bedömas med avseende på förekomsten av mikrokärnor. System för automatiserad analys (bildanalys eller flödescytometrisk analys av cellsuspensioner) är godtagbara alternativ till manuell utvärdering om de är vederbörligen motiverade och validerade i förhållande till klassisk mikroskopisk poängsättning.(12)

VII. Förfarande för andra arter än råttor och möss

Publicerad information baserad på studier på möss, råttor, hamstrar, svin, hundar, icke-mänskliga primater och människor(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) tyder på att spontana och inducerade frekvenser av mikronukleerade erytrocyter är likartade hos de flesta däggdjursarter, och tyder på att mätning av förekomsten av mikronukleerade omogna erytrocyter i benmärgen är lämplig för att bedöma kromosom- eller spindelskador hos de arter som studerats hittills. Förekomsten och försvinnandet av mikronukleerade erytrocyter i benmärgen är en funktion av erytrogenesens kinetik och erytrocyternas livslängd hos varje art, och därför måste doserings- och provtagningsregimer ändras i enlighet med lämpliga parametrar för erytrocytkinetiken för varje art. Andra arter än möss och råttor kan användas när det är lämpligt, men följande information bör ingå:

• Berättigande av de valda arterna och de doserings- och provtagningsscheman som används i förhållande till erytropoesens kinetik och erytrocyternas livslängd hos de arter som används;
• Bevis på att frekvensen av spontana mikrokärnor är förenlig med publicerad information och/eller är förenlig inom det laboratorium som genomför studien;
• Bevis för att kända genotoxiska ämnen ger upphov till en ökning av mikronukleusfrekvensen hos de arter som används och referensvärden för storleken på den inducerade reaktionen;
• Inverkan av selektivt avlägsnande från mjälte av mikronukleerade celler från perifert blod (när det senare är den vävnad som övervakas).

VIII. Data och rapportering

A. Behandlingsresultat

Data från enskilda djur ska presenteras i tabellform. Försöksenheten är djuret. Antalet omogna erytrocyter som fått poäng, antalet mikronukleerade omogna erytrocyter och antalet omogna bland de totala erytrocyterna ska anges separat för varje analyserat djur. När djuren behandlas kontinuerligt i 4 veckor eller mer ska även uppgifter om mogna erytrocyter anges om de har samlats in. Andelen omogna bland de totala erytrocyterna och, om det anses tillämpligt, andelen mogna erytrocyter med mikrokärnor bör anges för varje djur. Om det inte finns några bevis för en skillnad i respons mellan könen kan uppgifterna från båda könen kombineras för statistisk analys.

B. Utvärdering och tolkning av resultat

Det finns flera kriterier för att fastställa ett positivt resultat, t.ex. en dosrelaterad ökning av antalet mikronukleerade celler eller en tydlig ökning av antalet mikronukleerade celler i en enda dosgrupp vid en enda provtagningstidpunkt. Statistiska metoder bör användas för att utvärdera testresultaten. 24, 35 De statistiska kriterierna för ett positivt, negativt eller tvetydigt resultat bör anges tydligt i protokollet. Eftersom biologiska faktorer kan modifiera tolkningen bör statistisk signifikans inte vara den enda avgörande faktorn för att nå en slutsats. Tvetydiga resultat bör klargöras genom ytterligare testning, eventuellt med hjälp av en ändring av försöksförhållandena.

Och även om de flesta experiment kommer att ge klart positiva eller negativa resultat, kommer datamängden i sällsynta fall att omöjliggöra en definitiv bedömning av testsubstansens aktivitet. Resultaten kan förbli tvetydiga eller tveksamma oavsett hur många gånger försöket upprepas.

Positiva resultat i mikronukleustestet indikerar att en substans inducerar mikronukleier, som är resultatet av kromosomskador eller skador på mitosapparaten i erytroblasterna hos testarten. Negativa resultat tyder på att testsubstansen under testförhållandena inte ger upphov till kromosomskador eller spindelskador som leder till bildning av mikrokärnor i de omogna erytrocyterna hos testarten.

Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter når den allmänna cirkulationen eller specifikt målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras. Påvisandet av adekvat exponering av målvävnad i ett negativt mikronukleustest är ett särskilt viktigt övervägande när det finns positiva bevis för genotoxicitet i ett eller flera andra testsystem.

C. Testrapport

Testrapporten ska också innehålla följande information:

1. Testämne

• identifikationsuppgifter och CAS-nr, om den är känd
• fysisk art och renhet
• fysikalisk-kemiska egenskaper som är relevanta för genomförandet av studien
• testämnets stabilitet, om den är känd

2. Lösningsmedel/fordon

• motivering för val av fordon
• testämnets löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/fordonet, om den är känd

3. Doseringslösningar

• tider då doseringslösningar framställdes och användes (eller intervall mellan framställning och användning), och förvaringsförhållanden
• data som verifierar koncentrationen av doseringslösningen, om de finns tillgängliga

4. Försöksdjur

• arter/stammar som använts, inklusive motivering
• antal, ålder och kön på djuren
• källa, inhysningsförhållanden, foder osv.
• individuell vikt för djuren i början av försöket, inklusive kroppsviktsintervall, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp
• information om eventuell påverkan av selektion av mjälte på förekomsten av mikronukleerade celler i det perifera blodet, i förekommande fall

5. Testförhållanden

• positiva och negativa (vehikel/lösningsmedel) kontrolldata
• data från en undersökning av räckvidden, om utförd
• grund för val av dosnivå
• detaljinformation om beredning av testsubstansen
• detaljinformation om administrering av testsubstansen
• grund för administreringsväg och doseringsschema
• metoder för att verifiera att testsubstansen nådde den allmänna cirkulationen och/eller målvävnaden, Om tillämpligt
• omräkning från koncentrationen av testsubstansen i diet/drickvatten (ppm) till den faktiska dosen (mg/kg kroppsvikt/dag), om tillämpligt
• uppgifter om livsmedels- och vattenkvalitet
• detaljbeskrivning av behandlings- och provtagningsscheman
• metoder för preparering av objektglas
• metoder för mätning av toxicitet
• kriterier för poängsättning av mikrokärniga omogna erytrocyter och, om det är lämpligt och tillämpligt, mogna erytrocyter
• antal celler som analyseras per djur
• kriterier för att betrakta undersökningar som positiva, negativa eller tvetydiga

6. Resultat

• Tillstånd till toxicitet
• Andelen omogna erytrocyter av de totala erytrocyterna
• Antal mikronukleerade omogna erytrocyter av de totala omogna erytrocyterna, anges separat för varje djur
• Om det är lämpligt och tillämpligt, antal mikronukleerade mogna erytrocyter av de totala mogna erytrocyterna, anges separat för varje djur
• medelvärde ± standardavvikelse av mikronukleerade omogna och, i förekommande fall, mogna erytrocyter per grupp
• dos-responsförhållande, om möjligt
• statistiska analyser och motivering av den tillämpade metoden, med lämplig litteraturhänvisning
• samtidiga och historiska negativa kontrolluppgifter
• samtidiga och historiska positiva kontrolluppgifter

7. Diskussion av resultaten

8. Slutsats

XI. Addendum: Identifiering av mikrokärnor som härrör från acentriska fragment jämfört med centromeriska kromosomer

Mikronkärnor kan bildas av acentriska fragment eller hela kromosomer som släpar efter i mitosen. Dessa sistnämnda mikronukleier identifierades först genom sin stora storlek,(49) genom C-bandning(47) eller genom mätning av DNA-innehållet.(46) Dessa metoder var dock inte särskilt tillförlitliga. Därför utvecklades två molekylärcytogenetiska metoder för att identifiera närvaron av centromerer i mikrokärnor och därmed skilja mellan mikrokärnor av klastogent och aneugeniskt ursprung:(12) 1) immunofluorescerande CREST-färgning och 2) fluorescens in situ-hybridisering (FISH) med pankentromeriska DNA-sonder. När det är mekanistiskt viktigt att bestämma närvaron av kinetokor eller centromer i mikrokärnorna kan dessa metoder tillämpas.

CREST-metoden som tillämpas på benmärgsmikronukleustestet beskrivs i detalj av Miller och Adler. 33) Celler på objektglas (normala benmärgsutstryk) fixeras, dehydratiseras, inkuberas i två steg med SDS och Triton-X, och färgas sedan med antikropp. DNA motfärgas med Hoechst 33258.

Med FISH används minor satellite DNA-proben som hybridiserar nära centromer(43) för att identifiera den centromeriska regionen, om den finns. En metod för FISH med de centromeriska DNA-proberna har beskrivits av Pinkel et al.(34) Denna metod kan tillämpas på flödessorterade erytrocyter som innehåller mikronukleier(10) eller på isolerade mikronukleier som erhållits från perifera blodprover.(13)

I kontrollglas är andelen märkta mikrokärnor som innehåller den centromeriska regionen cirka 50 %.(43) Cirka 70 % av de mikrokärnor som induceras av kända aneugener (colchicin och vinblastin) märks,(33) medan de som induceras av klastogener (hydrokinon och mitomycin C) endast uppvisar 5-15 % märkta mikrokärnor.(33) För att karakterisera den relativa klastogena kontra aneugena aktiviteten hos en kemikalie är det användbart att som index använda antalet mikronukleerade polykromatiska erytrocyter per 1000 polykromatiska erytrocyter som innehåller den centromeriska regionen.(42)

Den största bristen i de FISH-metoder som hittills har beskrivits är att de inte skiljer mellan normokromatiska och polykromatiska erytrocyter.(12) Endast preparat där en stor del av de närvarande mikrokärnorna induceras av testartikeln är lämpliga för analys. Exempelvis är perifera blodprover från experiment med akut exponering av vuxna djur i princip aldrig lämpliga för analys, eftersom målcellspopulationen (omogna erytrocyter) endast utgör 3-5 % av erytrocyterna i provet.

Slutsatsen är att CREST- eller FISH-märkning anses vara tillförlitliga metoder för att upptäcka aneugena egenskaper hos kemikalier i in vivo mikronukleusanalysen, förutsatt att man är uppmärksam på att se till att lämpliga prover används för analysen. 12) De nuvarande metodernas komplexitet begränsar dock användningen av dem till de fall där man misstänker att en kemikalie orsakar spindelskada (t.ex, på grund av förekomsten av stora mikrokärnor, induktion av polyploidi etc.) eller när det finns andra specifika skäl att få denna mekanistiska information.

X. Referenser

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Induktion av mikrokärnor av bensen i B6C3F1-möss: Retrospektiv analys av perifera blodprover från NTP:s bioassay för karcinogenes. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. och Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Rekommenderat protokoll för kortsiktigt mikronukleustest med perifert blod av mus. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. och MacGregor, J.T. (1988). Association of Marginal Folate Depletion with Increased Human Chromosomal Damage In Vivo: Demonstration by Analysis of Micronucleated Erythrocytes. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. och Richold, M. (1992). Rapport från arbetsgruppen för British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). In Vivo Rat Micronucleus Test: Integration med en 14-dagarsstudie. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Provstorlek för uppskattning av förhållandet mellan polykromatiska och normokromatiska erytrocyter i benmärgsmikronukleustestet. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. and Adler I.-D.. (1997). Kvantitativa och kvalitativa studier av mikronukleusinduktion i musens erytrocyter med hjälp av flödescytometri: I. Mätning av mikronukleusinduktion i polykromatiska erytrocyter i perifert blod av kemikalier med känd och misstänkt genotoxicitet. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Utvärdering av långtidsmikronukleustestet för gnagare: Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. och Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay: II. Vissa aspekter av protokollets utformning inklusive upprepade behandlingar, integrering med toxicitetstestning och automatiserad poängsättning. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Isolering av mikrokärnor från musblod, Fluorescence In Situ Hybridization with a Mouse Centromeric DNA-Probe. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990). Mikronukleustest med retikulocyter från musens perifera blod med hjälp av acridinorange-belagda objektglas. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983). En tillämpning av Acridine Orange Fluorescent Staining på mikronukleustestet. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. och Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. och Newell, G.W. (1983). Induktion av mikrokärnor som ett mått på genotoxicitet. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induction of Micronuclei in Rat Bone Marrow and Peripheral Blood Following Acute and Subchronic Treatment with Azathioprine. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). En optimal, generaliserad provtagningstid på 30 ±6 h efter dubbel dosering i mikronukleustestet för musens perifera blod. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadiene: Induktion av mikronukleerade erytrocyter i det perifera blodet hos B6C3F1-möss som exponerats genom inandning i 13 veckor. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validering av utvärdering av mikrokärnor hos råtta med hjälp av flödescytometri med fem modellföreningar. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation into Routine Toxicology Studies: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. och Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). Effekten av exponeringsregim och exponeringstid på benseninducerad benmärgsskada hos möss. I. Könsjämförelse hos DBA/2-möss. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. och Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N. och Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes (mikrokärnor i cirkulerande erytrocyter): A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: ”Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Grunden för ett förbättrat mikronukleustest. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. och Shelby, M.E. (1990). In Vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. och Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimoninducerad kromosomskada i benmärgsceller från sex däggdjursarter. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. och Heddle, J.A. (1990). In Vivo Micronucleus Assay i benmärg och perifert blod från däggdjur. En rapport från U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. och Adler I.-D. (1990). Tillämpning av Antikinetochore Antibody Staining (CREST Staining) på mikrokärnor i erytrocyter inducerade in vivo. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Cytogenetisk analys med hjälp av kvantitativ, högkänslig fluorescenshybridisering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. och Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Del I reviderad. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.
36. Romagna, F. and Staniforth , C.D.(1989). Det automatiserade benmärgsmikronukleustestet. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). En snabb screening för kumulativa kromosomskador hos möss. Ackumulering av cirkulerande mikronukleerade erytrocyter. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). Persistens av mikrokärnor i erytrocyter från perifert blod: Detection of Chronic Chromosome Breakage in Mice. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. and MacGregor, J.T. (1984). Persistens av mikronukleerade erytrocyter i den perifera cirkulationen hos normala och splenektomerade Fischer 344-råttor: Implikationer för cytogenetisk screening. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. och Everson, R.B. (1986). Bedömning av cytogenetiska skador genom kvantifiering av mikrokärnor i erytrocyter från mänskligt perifert blod. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). Mikronukleustestet. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. och Adler I.-D. (1997). Differentiering av mikrokärnor i benmärgsceller från mus: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D.. (1994). Extruderade mikrokärnor inducerade av kolchicin eller akrylamid innehåller mestadels eftersläpande kromosomer som identifieras i målarborstfläckar med hjälp av mindre och större DNA-sonder för mus. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Mätning av mikronukleerade erytrocyter och DNA-skador vid kroniskt intag av fenolftalein hos transgena kvinnliga möss som är heterozygota för p53-genen. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. and Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L. och Kirsch-Volders M. (1989). Micronukleustestet för musens benmärg kan användas för att skilja aneugena från klastogena ämnen. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K. och Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Fenolftalein: Induktion av mikronukleerade erytrocyter hos möss. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. och Kikuchi Y. (1980). En jämförelse av diametern hos mikrokärnor som inducerats av klastogener och av spindelgifter. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. och Kikuchi Y. (1981). Studier av mikrokärnors tidsrespons och av effekterna av flera behandlingar med mutagena ämnen på induktion av mikrokärnor. Mutation Res. 90:163-173.