Då noggrann proteinkvantifiering är nödvändig för alla experiment som rör proteinstudier har olika metoder utvecklats för att mäta koncentrationen av proteiner i en viss analys. Några av de mer traditionella metoderna för kvantifiering av totalprotein är mätning av UV-absorbans vid 280 nm (A280), Bicinchoninsyra (BCA) och Bradford-analyser samt andra alternativa metoder som Lowry- och andra nya analyser.
Då proteiner absorberar ljus vid en specifik våglängd kan mätning erhållas med hjälp av en spektrofotometer. Särskilt aminosyrorna tyrosin och tryptofan har en mycket specifik absorption vid 280 nm, vilket möjliggör direkt A280-mätning av proteinkoncentrationen.
UV-absorption vid 280 nm används rutinmässigt för att uppskatta proteinkoncentrationen i laboratorier på grund av dess enkelhet, användarvänlighet och överkomlighet. Mätningarna är snabba och mycket reproducerbara eftersom det inte behövs någon inkubation. Dessutom kräver denna metod också en extremt liten provvolym eftersom moderna spektrofotometrar använder ett system för provretention under mätningen.
Man bör dock se till att proteinprovet inte innehåller några icke-proteinkomponenter (t.ex. nukleinsyror) med samma absorptionsspektrum eftersom det kan leda till felaktiga resultat. Förutom att bestämma proteinkoncentrationer kan absorbansvärden också användas för att upptäcka konformationsförändringar och ligandbindning och för att följa enzymreaktioner.
Tryptofans och tyrosins effekt vid proteinkvantifiering
På grund av närvaron av tyrosin och tryptofan absorberar proteiner och peptider som innehåller dessa aromatiska aminosyror UV-ljus vid en våglängd på 280 nm. Var och en av dessa rester har distinkta absorptions- och emissionsvåglängder och varierar i kvantutbyte. Fenylalanin och disulfidbindningar bidrar också till absorptionen vid denna våglängd, men eftersom den är relativt obetydlig kan den endast observeras i frånvaro av både tryptofan och tyrosin.
Många enzymatiska kofaktorer som innehåller aromatiska ringstrukturer (t.ex. FMN, FAD, NAD och porfyriner) absorberar också UV-ljus för excitering och bidrar därför till intensiteten hos den resulterande fluorescensen. Speciella proteiner, t.ex. grönt fluorescerande protein, har också en intern serinetyrosin-glycin-sekvens som modifieras posttranslationellt och är fluorescerande i det synliga ljusområdet.
Tryptofan
Tryptofan är betydligt mer fluorescerande än tyrosin och fenylalanin. Dess fluorescerande egenskaper är dock lösningsmedelsberoende, dvs. spektrumet skiftar till kortare våglängder och ökar i intensitet när lösningsmedlets polaritet minskar. Tryptofanrester som är begravda i hydrofoba domäner i veckade proteiner uppvisar därför en spektralförskjutning på 10 till 20 nm.
På grund av dess större absorptionsförmåga, högre kvantutbyte och resonansenergiöverföring liknar fluorescensspektrumet hos ett protein som innehåller de tre aminosyrorna vanligen tryptofans spektrum.
Tyrosin
Tyrosin kan exciteras vid våglängder som liknar tryptofans, men kommer att emittera vid en klart annorlunda våglängd. Även om det kan vara sant att tyrosin är mindre fluorescerande än tryptofan kan det ge en betydande signal eftersom det ofta förekommer i stora mängder i många proteiner. Tyrosinfluorescensen har observerats släckas av närvaron av närliggande tryptofanrester antingen genom resonansenergiöverföring eller jonisering av dess aromatiska hydroxylgrupp.
Här är några viktiga punkter att komma ihåg när man mäter peptider med A280-metoden.
- Proteiner med liknande molekylvikt kan ha olika absorbansvärden på grund av skillnaden i tryptofan och tyrosininnehåll.
- UV-absorptionen påverkas också av proteinstrukturen. Sålunda kan förhållanden som påverkar strukturen (t.ex. temperatur, pH, jonstyrka eller närvaro av tvättmedel) påverka de aromatiska resternas förmåga att absorbera ljus vid 280 nm och ändra värdet på proteinets extinktionskoefficient.
- Den lokala miljön för de aromatiska aminosyrorna kan ha en effekt på deras spektrum. Detta innebär att tryptofan kommer att ha en emissionstopp vid lägre våglängder när det är begravt i de hydrofoba inre regionerna av ett protein medan tyrosin ofta överför sin energi till intilliggande tryptofanaminosyror. Joniserat tyrosinat, som bildas när protoner förloras från tyrosin till följd av ökat pH, kommer att uppvisa våglängder som liknar tryptofans.