Tehokas 3-hydroksipropionihapon tuotanto glyserolista metabolisesti muunnetulla Klebsiella pneumoniae -bakteerilla

Tuotettaessa 1,3-propaanidiolia tai 3-HP:tä glyserolista maitohappo on merkittävä sivutuote, joka pienentää tuotteen saantia merkittävästi. Siksi laktaattituotantoa on yritetty vähentää poistamalla laktaattidehydrogenaasia koodaava geeni (Kumar ym. 2013b; Zhong ym. 2014). Koska molemmat 1,3-propaanidiolia ja 3-HP:tä muodostavat reaktiot kilpailevat yhteisestä substraatistaan 3-hydroksialdehydistä (3-HPA), propaanidiolioksididuktaasin deletointi suosii 3-HP:n tuotantoa (Ashok ym. 2011). Siksi tässä tutkimuksessa geenit ldhA ja dhaT tyrmättiin 3-HP:n tuotannon tehostamiseksi.

LdhA:n puutteen vaikutus 3-HP:n tuotantoon

LdhA-puutteinen kanta JJQ01 konstruoitiin ja ldhA:n tyrmääminen vahvistettiin, kuten kuvassa S2A esitetään. Rekombinanttikannat Kp4(pUC18-kan-aldH) ja JJQ01(pUC18-kan-aldH) konstruoitiin ja fed-batch-fermentoinnit suoritettiin 5-L bioreaktorissa. Solujen kasvun, glyserolin kulutuksen ja aineenvaihduntatuotteiden tuotannon profiilit esitetään kuvissa 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) tuotti 38 tunnissa 18,3 g/l 3-HP:tä saannon ollessa 0,21 mol/mol, kun taas maitohappo saavutti 32,2 g/l saannon ollessa korkeampi, 0,34 mol/mol. Lisäksi tuotettiin 17,6 g/l 2,3-butaanidiolia, 6,1 g/l 1,3-propaanidiolia ja 10,7 g/l etikkahappoa. Laktaatin muodostuminen lisää paitsi kustannuksia myös vaikeuttaa 3-HP:n, joka on laktaatin isomeeri, talteenottoa. Lisäksi laktaatti on 3-HP:n ja 1,3-propaanidiolin biosynteesin pääasiallinen estäjä (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). LdhA:n puute poisti laktaatin muodostumisen tehokkaasti, ja 3-HP:n tuotanto saavutti 48,3 g/l saannon ollessa 0,28 mol/mol, kuten kuvassa 2b on esitetty. Tämän ldhA-puutteisen kannan 3-HP:n pitoisuus oli 1,64-kertainen ja saanto 33,3 % suurempi kuin Kp4(pUC18-kan-aldH)-kannassa. Pientä etanolinmuodostusta (noin 4 g/l) lukuun ottamatta ldhA-mutantti-kannassa ei havaittu pyruvaatin ja formiaatin kertymistä, joita ei juuri havaittu käytettäessä villityypin kantaa.

Nämä tulokset osoittivat selvästi, että maitohappotuotannon estäminen ohjasi hiilivirtausta huomattavasti uudelleen 3-HP:n tuotantoon. Glyserolin assimilaatio DhaB:n kautta parani merkittävästi, lähes 0,4 mol/mol glyserolia ohjattiin DhaB:n kautta 3-HP:hen, mikä oli yhdenmukainen muiden tutkimusten kanssa (Kumar ym. 2013b; Xu ym. 2009b). Laktaatin vähentäminen voisi alentaa myrkyllisyyttä soluille, suosi solujen kasvua ja 3-HP:n tuottavuutta. Laktaatin vähentäminen lisäsi kuitenkin myös 2,3-butaanidiolin ja 1,3-propaanidiolin muodostumista, joka saavutti 21,9 g/l saannolla 0,13 mol/mol ja 18,5 g/l saannolla 0,12 mol/mol. ldhA-deleetion vuoksi lisääntyneestä 3-HP:n kertymisestä peräisin oleva ylimääräinen NADH saattaa edistää 2,3-butaanidiolin ja 1,3-propaanidiolin tuotantoa laktaatin sijasta NAD+:n regeneroimiseksi ja redox-tasapainon säilyttämiseksi. Itse asiassa etanolin muodostuminen tuki myös NAD+:n regeneroitumista, mikä johti suurempaan virtaukseen pyruvaatista etanoliin kuin virtaukseen pyruvaattiin.

DhaT:n puutteen vaikutus 3-HP:n tuotantoon

LdhA:n poistaminen lisäsi dramaattisesti 3-HP:n tuotantoa, ja samalla myös 1,3-propaanidiolin tuotanto lisääntyi 18,5 g/l:aan. Ko et al. (2017) raportoivat, että asetaattia ja muita sivutuotteita pelkistämällä saatiin 43 g/L 3-HP:tä ja 21 g/L 1,3-propaanidiolia. Vaikka 1,3-propaanidiolin muodostuminen hyödyttää glyserolin hyödyntämistä regeneroimalla kofaktoria, se muodostaa merkittävän osan glyserolin hiilivirrasta. Koska 1,3-propaanidioli ja 3-HP kilpailevat samasta esiasteesta 3-HPA:sta, 1,3-propaanidiolin virtauksen rajoittamiseksi rakennettiin ldhA- ja dhaT-kaksoiskannat (esitetty lisätiedostossa 1: kuva S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). Syöttöeräkäymisen tulokset 5 litran reaktorissa on esitetty kuvassa 2c. Yllättäen samanaikaisella ldhA- ja dhaT-kopioinnilla saatiin vain 44,5 g/l 3-HP:tä, vaikka saanto nousi 0,32 mol/mol glyserolia. dhaT:n poisto johti 1,3-propaanidiolin titrauksen ja saannon vähenemiseen 9,9 g/L:ään ja 0,07 mol/mol:iin. YqhD:n ja muiden oksidoreduktaasien katalysoimassa reaktiossa tuotettiin kuitenkin edelleen 1,3-propaanidiolia (Ashok ym. 2013). Lisäksi verrattuna JJQ01(pUC18-kan-aldH) -molekyyliin 2,3-butaanidiolin tuotanto lisääntyi hieman 21,9:stä 23,4 g/L:ään, mikä osoittaa, että 2,3-butaanidiolin reitin virtausta lisättiin ALDH:n katalysoimasta reaktiosta peräisin olevan ylimääräisen NADH:n kuluttamiseksi. 1,3-propaanidiolisynteesillä on keskeinen rooli K. pneumoniaen redox-tasapainon säätelyssä. Hapettumisreitillä yhden asetaattimolekyylin muodostaminen glyserolista tuottaa kolme molekyyliä NADH:ta, ja samalla muodostuu yksi molekyyli ATP:tä. Näin ollen sekä ldhA:n että dhaT:n poistaminen vähensi huomattavasti NAD+:n regeneroitumiskykyä, ja enemmän NADH:ta hapettui 2,3-butaanidiolin muodostumisen kautta, mikä johti 2,3-butaanidiolin lisääntymiseen. Ilmastusnopeuden vähentäminen (hapen saannin rajoittaminen) saattoi lisätä asetaattituotantoa, jotta saataisiin enemmän ATP:tä, mutta samalla muodostui enemmän NADH:ta, mikä johti edelleen lisääntyneeseen 2,3-butaanidiolin tuotantoon. Regeneroitunut NAD+ näytti kuitenkin olevan vähemmän kuin DhaT:n katalysoimassa reaktiossa muodostunut NAD+, mikä johti pienempään 3-HP:n tuotantoon. Siksi sopivan happimäärän tarjoaminen NAD+:n tuottamiseksi vaikuttamatta DhaB:n aktiivisuuteen ja glyserolin dissimilaatioon on kriittistä 3-HP:n tuotannolle mikroaerobisessa fermentaatiossa.

Tässä tutkimuksessa ei onnistuttu parantamaan 3-HP:n tuotantoa poistamalla dhaT-geeni. Glyserolin dissimilaatiota säätelevät glyserolidehydrogenaasi DhaD, glyserolikinaasi GlpK, glyserolidehydraataasi DhaB ja 1,3-propaanidiolin oksidoreduktaasit 1,3-PDOR. Glyserolin haarautumispisteen jäykkyys merkitsee, että 3-HP:n tuotannon parantaminen glyserolivirran jakautumiseen osallistuvien geenien poistamisella on vaikeaa. Ashok et al. (2011) olivat määritelleet DhaD:n, DhaB:n, ALDH:n ja 1,3-PDOR:ien luontaiset aktiivisuudet dhaT-geenin poistamisen jälkeen. He havaitsivat, että DhaD:n aktiivisuus parani hieman, ALDH:n aktiivisuus laski hieman ja DhaB:n aktiivisuus laski merkittävästi. Zhang et al. (2008) analysoivat myös glyserolin dissimilaatiopolun haarautumispisteiden kestävyyttä. Osoittautui, että hiilivirran jakautuminen reduktiivisen ja oksidatiivisen haaran välillä oli vankka ympäristöolosuhteisiin nähden.

Ilmastuksen vaikutus 3-HP:n tuotantoon

Aiemmat tutkimuksemme osoittivat, että mikroaerobiset olosuhteet olivat suotuisat 3-HP:n tuotannolle. Verrattuna anaerobiseen prosessiin mikroaerobisessa fermentoinnissa 3-HP:n tuotanto lisääntyi merkittävästi aldehydidehydrogenaasin korkeamman ekspressiotason vuoksi, ja samalla 1,3-propaanidiolin tuotanto väheni (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) raportoivat, että glyserolidehydraasin spesifinen aktiivisuus K. pneumoniae -bakteerissa ilmastusnopeudella 0,04 vvm oli 59 % suurempi kuin ilman ilmansyöttöä. On kuitenkin raportoitu, että happi voi inaktivoida glyserolidehydraasin nopeasti (Toraya 2000; Ruch ja Lin 1975) ja vaikuttaa merkittävästi 3-HP:n tuotantoon (Xu ym. 2009a; Huang ym. 2013; Niu ym. 2017). Lisäksi koentsyymi B12:ta, joka on DhaB:n kofaktori, ei syntetisoida riittävästi korkeissa ilmastusolosuhteissa useimmissa luonnollisissa 3-HP:n tuottajissa, kuten K. pneumoniae:ssa. Huang et al. (2013) ja Ko et al. (2017) osoittivat myös, että erittäin aerobiset olosuhteet eivät ole suotuisia 3-HP:n tuotannolle. Siksi teimme alustavia syöttöeräkokeita erilaisissa ilmastusolosuhteissa ja havaitsimme myös, että korkean ilmastusnopeuden ylläpitäminen oli epäedullista 3-HP:n tuotannolle sen jälkeen, kun solujen kasvu loppui (tietoja ei ole esitetty). JJQ02:n (pUC18-kan-aldH) syöttöeräkasvatuksessa otimme käyttöön ilmastusnopeuden, joka oli puolet alkuperäisestä nopeudesta, kun OD650 oli suljettu maksimiarvoon. Kasvun, glyserolin ja aineenvaihduntatuotteiden profiilit on esitetty kuvassa 3, ja musta nuoli osoitti ajankohdan, jolloin ilmastusnopeutta alennettiin (0,5 vvm).

Lopullinen 3-HP:n titraus saavutti 61.9 g/l saannon ollessa 0,58 mol/mol 5 L:n reaktorissa 38 h:ssa. 3-HP:n pitoisuus ja saanto JJQ02:lla (pUC18-kan-aldH) olivat 3,3- ja 2,76-kertaiset verrattuna Kp4:lla (pUC18-kan-aldH) saatuihin pitoisuuksiin ja 3-HP:n saanto oli 1,28- ja 2,07-kertainen verrattuna JJQ01:lla (pUC18-kan-aldH) saatuihin pitoisuuksiin. Tulokset osoittivat, että sekä 1,3-propaanidiolin että 2,3-butaanidiolin tuotanto pysähtyi 20 tunnin kohdalla. 3-HP:n titteri kasvoi kuitenkin edelleen, vaikka tuotantonopeus laski tästä ajankohdasta alkaen. Mikroaerobisen fermentaation myöhemmässä vaiheessa, vaikka 1,3-propaanidiolin ja 2,3-butaanidiolin muodostumisen kautta regeneroitui vain vähän NADH:ta, jonkin verran NADH:ta voitiin silti regeneroida elektroninsiirtoketjun kautta, koska NAD+:n regenerointi tapahtuu tehokkaimmin elektroninsiirtoketjun kautta hapen läsnä ollessa (Richardson 2000; Kumar et al., ). 2013b), mikä johti 3-HP:n lisääntymiseen ilman 1,3-propaanidiolin ja 2,3-butaanidiolin selvää lisääntymistä.

300-L:n skaalausfermentaatio

Tarkistaaksemme kannan JJQ02(pUC18-kan-aldH) soveltuvuutta 3-HP:n tuotantoon suuremmassa bioreaktorissa, suoritettiin syöttöeräfermentaatio 300-L:n bioreaktorissa 5-L:n bioreaktorissa luotujen fermentaatio-olosuhteiden mukaisesti. Käytössä oli kaksivaiheinen ilmastusstrategia; ilmastusnopeus alennettiin puoleen mustan nuolen aikapisteessä, kuten kuvassa 4 on esitetty. 3-HP:n pitoisuudeksi saatiin 54,5 g/l ja saannoksi 0,43 mol/mol, ja konsentraatio ja saanto olivat 12,2 g/l ja 0,11 mol/mol 1,3-propaanidiolin osalta, 21,3 g/l ja 0,11 mol/mol 1,3-propaanidiolin osalta.17 mol/mol 2,3-butaanidiolille ja 9,3 g/L ja 0,11 mol/mol asetaatille 51 h:ssa (kuva 4).

Vertailtuna 5-L reaktorissa saatuihin tuloksiin, 2,3-butaanidiolin titraus ja molaarinen saanto 300-L reaktorissa kasvoivat selvästi, ja ne olivat samankaltaisia kuin samassa kannassa 5-L:n reaktorissa vakiolla ilmastusnopeudella, joka oli 1 vvm. Se viittasi siihen, että hapen siirtyminen 300-L-reaktorissa saattaa olla jonkin verran suurempaa kuin 5-L-reaktorissa pienemmällä ilmastusnopeudella, koska jotkin tutkimukset ovat osoittaneet, että 2,3-butaanidiolin tuotanto edellyttää sopivaa ilmastusnopeutta (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Ilmastusolosuhteissa 300 L:n reaktorissa 2,3-butaanidiolin muodostumiseen liittyvien entsyymien ilmentyminen ja NADH-allas tai NADH/NAD+ -suhde edistivät 2,3-butaanidiolin tuotantoa, ja DhaB:n ja AldH:n ilmentyminen saattoi hieman vaikuttaa.

Redox-tasapainon kannalta ldhA dhaT-kaksoismutantti-kannassa ALDH:n katalysoimassa reaktiossa muodostunut NADH regeneroitui osittain 2,3-butaanidiolin ja muiden pelkistyneiden aineenvaihduntatuotteiden, kuten etanolin ja sukkinaatin, muodostumisen kautta ja osittain elektroninkuljetusketjun kautta (Richardson 2000; Kumar ym. 2013b). Siksi ilmastusnopeus mikroilmastusfermentaatiossa vaikutti merkittävästi lopputuotteisiin. Fermentoinnissa 300 litran reaktorissa, vaikka ilmastusnopeutta vähennettiin puoleen alkuperäisestä, hapensiirtotilanne saattoi silti poiketa huomattavasti 5 litran reaktorin hapensiirtotilanteesta erilaisten hapensiirto-ominaisuuksien vuoksi, mikä oli perinteinen aihe bioprosessien skaalauttamisessa. Tuotteiden jakautumisen erot eri reaktoreissa osoittivat hapen saannin tarkan hallinnan tärkeyden, kun taas pelkkä ilmastusnopeuden vähentäminen vaikutti liian karkealta. Vaikka 3-HP:n titraus ja saanto poikkesivat hieman 5 litran reaktorissa saaduista tuloksista, skaalaus onnistui kuitenkin hyvin. Koska hapensiirron suorituskyky 300 litran reaktorissa oli erilainen kuin 5 litran reaktorissa, odotettiin, että ilmastusnopeuden tarkempi säätäminen 300 litran reaktorissa voisi parantaa 3-HP-tasoa.