Tiokolikikosidin säilyvyystutkimukset irtotavarana ja kapseleissa käyttäen RP-HPTLC/Densitometriaa

Joitakin analyysimenetelmiä, kuten LC-ESI-MS RP-HPLC ja UV-spektrofotometriset menetelmät, on kehitetty pelkästään tiokolkikosidin määrittämiseksi irtotavarasta ja farmaseuttisista valmisteista.

Tiokolikikosidia on saatavana yhdistelmänä monien muiden lääkkeiden kanssa, minkä vuoksi useita menetelmiä, kuten UV-spektrofotometrisiä , RP-HPLC- ja HPTLC-menetelmiä, on tutkittu tiokolikikosidin määrittämiseksi yhdistetyissä lääkemuodoissa.

Kansainvälisen yhdenmukaistamiskonferenssin (ICH) ohjeissa ”Stability Testing of New Drug Substances and Products” (uusien lääkeaineiden ja -tuotteiden säilyvyystestaus) edellytetään, että vaikuttavan aineen luontaisten säilyvyysominaisuuksien selvittämiseksi voidaan tehdä rasituskokeita. Ihanteellinen stabiilisuutta osoittava menetelmä on sellainen, jossa erotetaan sekä vakiolääke että sen hajoamistuotteet . Näin ollen on kehitettävä luotettava ja nopea määritysmenetelmä, jota voitaisiin käyttää myös hajoamiskomponenttien optimaaliseen erottamiseen perusyhdisteestä. Tietojemme mukaan kirjallisuudessa ei kuitenkaan ole mainittu yhtään artikkelia, joka liittyisi tiokolkikosidin stabiilisuutta osoittavaan RP-HPTLC-määritykseen. Tässä artikkelissa kuvatun työn tavoitteena on luoda olosuhteet tiokolkikosidin tunnistamiseksi ja kvantitatiiviseksi analysoimiseksi sen hajoamistuotteiden läsnä ollessa, jotta voidaan arvioida irtolääkkeen puhtautta ja sen annostelumuotojen pysyvyyttä. Stabiilisuutta osoittavan RP-HPTLC-menetelmän soveltuvuus tiokolkikosidin kvantitatiiviseen määritykseen osoitettiin validoimalla se ICH-ohjeiden vaatimusten mukaisesti.

2. Kokeellinen

2.1. Kokeellinen

. Kemikaalit ja reagenssit

Thiocolchicoside saatiin lahjanäytteenä Ajanta Pharmalta. Ltd, Mumbai, Intia. HPLC-luokan metanoli, HCl, NaOH ja H2O2 ostettiin Merck Chemicalsilta, Intia.

2.2. HPLC-luokan metanoli. HPTLC-laitteisto

Lääkevalmistestandardi ja näytteet pisteytettiin 6 mm:n levyisinä kaistaleina CAMAG Linomat -mikrolitrausruiskulla (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Sveitsi) käyttäen CAMAG Linomat 5-näytteen annostelulaitetta (CAMAG Muttenz, Sveitsi), jossa annostelunopeus on vakio, 150 nL sekunnissa. Levyt esipestiin metanolilla ja aktivoitiin 100 °C:ssa 10 minuutin ajan ennen kromatografiaa. Kromatografia suoritettiin alumiinilevyillä, jotka oli esipinnoitettu silikageelillä 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Saksa). Lineaarinen nouseva kehitys, jossa liikkuvana faasina oli metanoli: vesi (70 : 30 v/v), suoritettiin 20 × 10 cm:n kaksoiskourun lasikammiossa (CAMAG Muttenz, Sveitsi). Optimoitu kammion kyllästymisaika liikkuvalle faasille oli 30 minuuttia huoneenlämmössä (28 ± 2 °C). Kromatogrammiajon pituus oli noin 80 mm. Levyn kehitysaika oli 25 minuuttia. Kehittämisen jälkeen levyt kuivattiin ilmavirrassa ilmankuivaimella. Pisteiden havaitseminen suoritettiin 377 nm:ssä CAMAG TLC Scanner 3 -laitteella absorbanssitilassa, jota käytettiin winCATS-ohjelmiston versiolla 1.3.0. Säteilylähteenä käytettiin deuteriumlamppua. Halkaisijan mitat olivat 6 mm × 0,45 mm ja skannausnopeus 20 mm sekunnissa.

2.3. Varastostandardin valmistaminen

Varastostandardiliuos 1 mg/ml tiokolkikosidia metanolissa.

2.4. Lineaarisuustutkimus

Varastostandardiliuos välillä 0,2-1,2 ml siirrettiin kuuteen erilliseen 10 ml:n mittapulloon ja tilavuus täytettiin metanolilla. Jokaisesta edellä mainitusta liuoksesta levitettiin 5 μL RP-HPTLC-levyille, jotta saatiin konsentraatio välillä 100-600 ng kaistaa kohti. Menetelmän kalibrointikaavio muodostettiin piikin pinta-alan ja lääkeainekonsentraation suhteen.

2.5. Näyteliuoksen valmistaminen

Tiokolikikosidipitoisuuden määrittämiseksi kapselissa punnittiin kaksikymmentä kapselia (MYORIL, pakkausmerkinnän väittämä: 8 mg tiokolikikosidia per kapseli); kapseleiden sisältö poistettiin; ja määritettiin keskimääräinen paino. 8 mg:aa tiokolkikosidia vastaava määrä siirrettiin 100 ml:n mittapulloon, joka sisälsi 50 ml metanolia, ja sonikoitiin 10 minuutin ajan; tilavuus säädettiin merkkiin ja suodatettiin Whatmann nro 41 -suodatinpaperilla. 5 ml:n tilavuus laimennettiin 10 ml:ksi metanolilla; tuloksena saatua 5 μL:n liuosta levitettiin RP-HPTLC-levylle tiokolkikosidin määritystä varten. Levyt kehitettiin ja skannattiin edellä kuvatulla tavalla.

2.6. Menetelmän validointi

Menetelmä validoitiin seuraavien parametrien osalta ICH-ohjeiden mukaisesti.

2.6.1. Tarkkuus

Näytteen annostelun toistettavuus ja piikin pinta-alan mittaus suoritettiin käyttäen kuutta toistoa testikonsentraatiosta (400 ng tiokolkikosidikaistaa kohti). Päivänsisäinen ja päivänsisäinen vaihtelu tiokolkikosidin estimoinnissa tehtiin käyttäen kolmea toistoa kolmella eri pitoisuudella (200, 300 ja 500 ng kaistaa kohti).

2.6.2. Vaihteluvirheiden arviointi Havaitsemisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ)

Havaitsemis- ja määritysrajan määrittämiseksi käytettiin kalibrointikäyrän lineaarisen alueen alaosassa olevia tiokolkikosidipitoisuuksia. Varastostandardiliuoksesta annosteltiin 100, 120, 140, 160, 180 ja 200 ng tiokolkikosidia kaistaa kohti kolminkertaisesti RP-HPTLC-levylle, ja LOD ja LOQ laskettiin seuraavien yhtälöiden avulla: missä ”” on lääkeaineiden piikkipinta-alojen standardipoikkeama (), joka otetaan kohinan mittana, ja ”” on vastaavan kalibrointikäyrän kaltevuus

2.6.3. Määritys- ja määritysmenetelmät. Spesifisyys

Menetelmän spesifisyys tarkistettiin analysoimalla lääkeainestandardi ja näyte. Näytteen tiokolkikosidikaista varmistettiin vertaamalla kaistan arvoja ja spektrejä lääkevalmistestandardin arvoihin ja spektreihin. Tiokolkikosidin piikin puhtaus varmistettiin vertaamalla spektrejä kolmella eri tasolla eli kaistan alkupään (), loppupään () ja loppupään () sijainneissa. Menetelmän kestävyys

Menetelmän kestävyys suoritettiin analysoimalla 400 ng tiokolkikosidia kahdella eri analyytikolla pitämällä samat koe- ja ympäristöolosuhteet.

2.6.5. Tarkkuus

Levylle levitettiin yhdeksän kaistaa tiokolkikosidinäyteliuosta (200 ng kaistaa kohti), minkä jälkeen levylle levitettiin tunnettu määrä tiokolkikosidia kolmena kappaleena 80, 100 ja 120 % (160, 200 ja 240 ng kaistaa kohti) näytekonsentraatiosta (200 ng kaistaa kohti) ja se analysoitiin uudelleen ehdotetulla menetelmällä. Tämä tehtiin lääkkeen talteenottotutkimuksen arvioimiseksi eri pitoisuuksilla valmisteissa.

2.6.6. Robustisuus

Tekemällä pieniä muutoksia liikkuvan faasin koostumukseen, liikkuvan faasin määrään, aikaan levityksestä kehitykseen ja aikaan kehityksestä skannaukseen tutkittiin vaikutuksia tuloksiin. Kokeiltiin liikkuvia faaseja, joiden eri koostumukset olivat metanoli: vesi (72 : 28 v/v) ja metanoli: vesi (68 : 32 v/v), ja ajettiin kromatogrammit. Levyt esipestiin metanolilla ja aktivoitiin 80 ± 5 °C:ssa 2, 5 ja 8 minuutin ajan ennen kromatografiaa. Menetelmän kestävyys testattiin käyttämällä kuutta toistoa samasta pisteestä (400 ng tiokolkikosidikaistaa kohti).

2.7. Tiokolkikosidin pakotettu hajoaminen

2.7.1. Happo- ja emäshydrolyysi

Tarkasti punnittu 10 mg:n määrä tiokolokikosidia liuotettiin erikseen 10 ml:aan metanolista liuosta 1,0 M HCl:n ja 0,5 M NaOH:n liuosta ja refluksoitiin 30 minuuttia 60 °C:ssa pimeässä valon todennäköisen hajottavan vaikutuksen välttämiseksi. Edellä mainituista liuoksista otettiin erikseen 1,0 ml, neutraloitiin ja laimennettiin 10 ml:aan metanolilla. Näin saadut liuokset levitettiin RP-HPTLC-levyille kolmena kappaleena (5 μL kutakin, eli 500 ng kaistaa kohti). Kromatogrammit kehitettiin ja skannattiin edellä kuvatulla tavalla.

2.7.2. Kromatogrammit kehitettiin ja skannattiin edellä kuvatulla tavalla. Hapettava hajoaminen

Hapettavaa hajoamista varten tarkasti punnittu määrä 10 mg tioklokosidia liuotettiin erikseen 10 ml:aan metanolista liuosta, jossa oli 1 % v/v H2O2 ja 3 % v/v H2O2, ja sitä pidettiin pimeässä huoneenlämmössä 30 minuuttia. Kummastakin edellä mainitusta liuoksesta otettiin 30 minuutin kuluttua 1,0 ml ja laimennettiin 10 ml:ksi metanolilla. Näin saadut liuokset levitettiin RP-HPTLC-levyille kolmena kappaleena (5 μL kutakin, eli 500 ng kaistaa kohti). Kromatogrammit kehitettiin ja skannattiin kuten edellä on kuvattu.

2.7.3. Kuivalämpöhajoaminen

Tarkasti punnittua 10 mg:n määrää tiokolkikosidia säilytettiin uunissa 70 °C:ssa 8 tuntia. Se siirrettiin 10 ml:n mittapulloon, joka sisälsi metanolia, ja tilavuus täytettiin merkkiin. Otettiin 1,0 ml edellä mainittua liuosta ja laimennettiin 10 ml:aan metanolilla. Näin saatu liuos levitettiin RP-HPTLC-levylle kolmena kappaleena (5 μL kutakin, eli 500 ng kaistaa kohti). Kromatogrammi kehitettiin ja skannattiin edellä kuvatulla tavalla.

2.7.4. Valokuvahajoaminen

Tarkasti punnittu määrä 10 mg tiokolkikosidia liuotettiin 10 ml:aan metanolia ja liuoksia pidettiin 24 tunnin ajan valossa. Edellä mainitusta liuoksesta otettiin sopiva määrä 1,0 ml ja laimennettiin 10 ml:aan metanolilla. Näin saatu liuos levitettiin RP-HPTLC-levylle kolmena kappaleena (5 μl kutakin, eli 500 ng kaistaa kohti). Kromatogrammi kehitettiin ja skannattiin edellä kuvatulla tavalla.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Kromatogrammi. Optimaalisen liikkuvan faasin kehittäminen

Tiokolkikosidin erottamiseen sopivan liikkuvan faasin valitsemiseksi tehtiin useita ajoja käyttäen liikkuvia faaseja, jotka sisälsivät eri polariteetteja sisältäviä liuottimia eri pitoisuustasoilla. Käytetyistä eri liikkuvista faasiyhdistelmistä liikkuvalla faasilla, joka koostui metanolista ja vedestä (70 : 30 v/v), saatiin terävä ja hyvin määritelty piikki arvolla 0,60 ± 0,02 (kuva 2). Hyvin erottuvat kaistat havaittiin, kun kammio kyllästettiin liikkuvalla faasilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä.

Kuva 2

Tiokolikikosidistandardin kromatogrammi, jossa ( 0,60 ± 0,02) 377 nm:ssä liikkuvassa faasissa metanoli: vesi (70 : 30 v/v).

3.2.3. Kromatogrammi. Kalibrointikäyrä

Kalibrointikäyrien () lineaariset regressiotiedot osoittivat hyvän lineaarisen suhteen pitoisuusalueella 100-600 ng kaistaa kohti. Lineaarisen regressioyhtälön todettiin olevan , = 0,9984 (kuva 3).

Kuva 3

Kalibrointikäyrä tiokolikikosidille (100-600 ng kaistaa kohti).

3.3. Kalibrointikäyrä. Menetelmän validointi

Kehitetty menetelmä validoitiin ICH-ohjeiden mukaisesti.

Menetelmän tarkkuus paljastui piikin pinta-alan suhteellisena standardipoikkeamana (% RSD). Tulokset (taulukko 1) kuvaavat menetelmän tarkkuutta, joka määritettiin kalibrointikaavion alimman osan kaltevuuden perusteella. LOD- ja LOQ-arvojen todettiin olevan 9,77 ng ja 29,63 ng, mikä osoittaa, että menetelmän herkkyys on riittävä.

3.4. Markkinoille saatetun valmisteen analyysi

Tiokolikikosidi kapselivalmisteesta uutettuna osoitti kromatogrammissa yhden pisteen, jolla oli = 0,60 ± 0,02. Keskimääräinen prosentuaalinen lääkeainepitoisuus oli 100,27 % pakkausmerkinnässä esitetystä pitoisuudesta 0,88 %:n RSD:n ollessa 0,88 %.

3.5. Tutkimusmenetelmät Stabiilisuutta osoittava ominaisuus

3.5.1. Hapan hajoaminen

Tiokolikikosidin pakkohajoaminen 1,0 M HCl:ssä (60 °C:ssa 30 minuutin ajan) todettiin epävakaaksi, ja siinä havaittiin kaksi ylimääräistä piikkiä arvoilla 0,33 ja 0,71 (kuva 5(a)). Hajoamistuotteiden pilkut erottuivat hyvin tiokolkikosidin pilkusta.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)