U.S. Food and Drug Administration

heinäkuu 2000

Toxicological Principles for the Safety Assessment of Food IngredientsRedbook 2000Luku IV.C.1..d. Nisäkkäiden erytrosyyttien mikronukleuskoe

Palaa Redbook 2000:n sisällysluetteloon

I. Johdanto

Mikrotumat ovat sytoplasman kromatiinia sisältäviä kappaleita, jotka muodostuvat, kun akentriset kromosomifragmentit tai kromosomit jäävät jäljelle anafaasin aikana eivätkä pääse liittymään tytärsolujen ytimiin solun jakautumisen aikana. Koska geneettiset vauriot, jotka johtavat kromosomikatkoksiin, rakenteellisesti epänormaaleihin kromosomeihin tai spindelin poikkeavuuksiin, johtavat mikrotumakkeiden muodostumiseen, mikrotumien esiintyvyys toimii tällaisten vaurioiden indeksinä. On todettu, että periaatteessa kaikki kaksisäikeisiä kromosomikatkoksia aiheuttavat aineet (klastogeenit) aiheuttavat mikrotumia. Koska mikrotumien laskeminen on paljon nopeampaa ja teknisesti vähemmän vaativaa kuin kromosomipoikkeavuuksien pisteytys ja koska mikrotumat syntyvät kahdesta tärkeästä geneettisen vaurion tyypistä (klastogeneesistä ja spindelin katkeamisesta), mikrotumakokeita on käytetty laajalti seulottaessa kemikaaleja, jotka aiheuttavat tämäntyyppisiä vaurioita.

Nämä ohjeet käsittelevät laajimmin käytettyä in vivo -mikrotumakokeita: nisäkkäiden erytrosyytti-mikrotumakokeita. Tätä in vivo -mikronukleustestiä käytetään testattavan aineen aiheuttamien kromosomivaurioiden tai erytroblastien mitoosilaitteen vaurioiden havaitsemiseen analysoimalla eläinten, yleensä jyrsijöiden, luuytimestä ja/tai perifeerisistä verisoluista otettuja erytrosyyttejä.

Mikrotumakokeen tarkoituksena on tunnistaa aineet, jotka aiheuttavat sytogeneettisiä vaurioita, jotka johtavat sellaisten mikrotumien muodostumiseen, jotka sisältävät jäljelle jääviä kromosomifragmentteja tai kokonaisia kromosomeja.

Kun luuytimen erytroblastista kehittyy monikromaattinen erytrosyytti, pääydin purkautuu ulospäin; muodostuneet mikrotumat voivat jäädä jäljelle muutoin enukleoituneeseen sytoplasmaan. Mikrotumien havaitseminen on helpompaa näissä soluissa käyttämällä erityisiä värjäystekniikoita ja koska niistä puuttuu päätydin. Mikrotumallisten polykromaattisten erytrosyyttien esiintymistiheyden lisääntyminen hoidetuissa eläimissä on osoitus indusoituneesta kromosomivauriosta.

II. Määritelmät

Sentromeeri (kinetokori) on kromosomin alue(et), johon kara-kuidut liittyvät solunjakautumisen aikana, mikä mahdollistaa tyttökromosomien järjestelmällisen liikkumisen tyttösolujen napoihin.

Mikrotumakkeet ovat pieniä, solujen päätumakkeista erillisiä ja ylimääräisiä tumia, jotka syntyvät mitoosin (meioosin) telofaasin aikana jäljelle jääneistä kromosomifragmenteista tai kokonaisista kromosomeista.

Normokromaattinen erytrosyytti on kypsä erytrosyytti, josta puuttuvat ribosomit ja joka voidaan erottaa epäkypsistä, polykromaattisista erytrosyyteistä ribosomeille selektiivisillä värjäyksillä.

Polykromaattinen erytrosyytti on kypsymätön, välivaiheessa oleva erytrosyytti, joka sisältää vielä ribosomeja ja voidaan siksi erottaa kypsistä, normokromaattisista erytrosyyteistä ribosomeille selektiivisillä värjäyksillä.

III. Alkuperäiset näkökohdat

Jyrsijöiden luuydintä käytetään rutiininomaisesti tässä testissä, koska kyseisessä kudoksessa tuotetaan polykromaattisia erytrosyyttejä. Mikroytimettömien epäkypsien (polykromaattisten) erytrosyyttien mittaaminen perifeerisestä verestä on yhtä hyväksyttävää kaikissa lajeissa, joissa pernan kyvyttömyys poistaa mikroytimettömiä erytrosyyttejä on osoitettu tai joissa on osoitettu riittävä herkkyys havaita rakenteellisia ja/tai numeerisia kromosomipoikkeavuuksia aiheuttavat aineet. Mikrotumat voidaan erottaa toisistaan useiden kriteerien perusteella. Näihin kuuluu kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n esiintymisen tai puuttumisen tunnistaminen mikrotumakkeissa. Mikrotumallisten epäkypsien (polykromaattisten) erytrosyyttien esiintymistiheys on pääasiallinen päätepiste. Kypsien (normokromaattisten) erytrosyyttien lukumäärää perifeerisessä veressä, jotka sisältävät mikrotumia tietyn määrän kypsien erytrosyyttien joukossa, voidaan myös käyttää määrityksen päätepisteenä, kun eläimiä hoidetaan yhtäjaksoisesti ajan, joka ylittää erytrosyytin eliniän tarkasteltavassa lajissa (esim. 4 viikkoa hiirellä), edellyttäen, että kyseisessä lajissa/kannassa ei tapahdu merkittävää pernaperäistä valikoitumista mikrotumaisia erytrosyyttejä vastaan. Mahdollisen pernaperäisen valikoitumisen seuraukset on selvitettävä perusteellisesti.

Tämä nisäkkäiden in vivo -mikrotumakoe on erityisen tärkeä mutageenisen vaaran arvioinnissa, koska sen avulla voidaan ottaa huomioon in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät, vaikka nämä voivat vaihdella lajeittain, kudoksittain ja geneettisten päätepisteiden välillä. In vivo -testi on myös hyödyllinen in vitro -järjestelmällä havaitun mutageenisen vaikutuksen jatkotutkimuksessa.

Jos on näyttöä siitä, että testattava aine tai reaktiivinen metaboliitti ei pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei ole tarkoituksenmukaista käyttää.

IV. Testimenetelmän periaate

Eläimet altistetaan testiaineelle sopivaa reittiä. Jos käytetään luuydintä, eläimet teurastetaan sopivana ajankohtana käsittelyn jälkeen, luuydin uutetaan, valmistetaan ja värjätään.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Jos käytetään perifeeristä verta, veri kerätään sopivana ajankohtana hoidon jälkeen ja preparaatit valmistetaan ja värjätään.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Preparaatit analysoidaan mikroytimien esiintymisen varalta.

V. Menetelmän kuvaus

A. Valmisteet

1. Eläinlajien valinta

Historiallisesti tähän määritykseen on käytetty rutiininomaisesti hiiriä tai rottia. Jos näytteenä käytetään luuydintä, voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa nisäkäslajia (ks. edellä III jakso). Kuten kaikissa toksikologisissa tutkimuksissa, sopivan lajin valinta on perusteltava. Kun käytetään perifeeristä verta, suositellaan hiiriä. Kuitenkin mitä tahansa sopivaa nisäkäslajia voidaan käyttää edellyttäen, että kyseessä on laji, jonka perna ei poista mikrotumaisia erytrosyyttejä, tai laji, joka on osoittanut riittävän herkkyyden havaita rakenteellisia ja/tai numeerisia kromosomipoikkeavuuksia aiheuttavia aineita. Olisi käytettävä yleisesti käytettyjä laboratoriokantoja nuorista terveistä eläimistä. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava minimaalista, eikä se saa ylittää ± 20 %:a kunkin sukupuolen keskipainosta.

2. Eläinten pito- ja ruokintaolosuhteet

Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava käytetylle lajille sopiva; hiirillä ja rotilla lämpötilan on oltava 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden tulisi olla vähintään 30 % ja mieluiten enintään 70 % muulloin kuin huoneen siivouksen aikana, tavoitteena tulisi olla 50-60 %. Valaistuksen olisi oltava keinotekoinen, ja sen olisi oltava 12 tuntia valoisaa ja 12 tuntia pimeää. Ruokinnassa voidaan käyttää tavanomaista laboratoriorehua ja rajoittamatonta juomavettä. Ruokavalion valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa, että testiaine saadaan sopivasti sekoitettua, kun se annetaan tätä kautta. Eläimet voidaan pitää yksittäin tai häkissä pienissä saman sukupuolen ryhmissä.

3. Eläinten valmistelu

Terveelliset nuoret täysikasvuiset eläimet on jaettava satunnaisesti kontrolli- ja hoitoryhmiin. Eläimet on tunnistettava yksiselitteisesti. Eläimet on totutettava laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on järjestettävä siten, että häkkien sijoittelusta johtuvat mahdolliset vaikutukset minimoidaan.

4. Annosten valmistelu

Kiinteät testiaineet on liuotettava tai suspendoitava sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen eläinten annostelua. Nestemäiset testiaineet voidaan annostella suoraan tai laimentaa ennen annostelua. Tutkittavasta aineesta on käytettävä tuoreita valmisteita, elleivät säilyvyystiedot osoita säilytyksen hyväksyttävyyttä.

B. Testiolosuhteet

1. Liuotin/kantaja-aine

Liuotin/kantaja-aine ei saa aiheuttaa toksisia vaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen epäillä reagoivan kemiallisesti testattavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin yleisesti käytettyjä liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttöä on tuettava viitetiedoilla, jotka osoittavat niiden yhteensopivuuden testattavan aineen ja eläinten kanssa. On suositeltavaa, että aina kun se on tarkoituksenmukaista, harkitaan ensin vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä.

2. Kontrollit

Kussakin jyrsijöillä suoritettavassa kokeessa on yleensä oltava jokaiselle sukupuolelle rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrollit. Kun mikronukleuskoe tehdään osana yleistä toksisuustutkimusta GLP-ohjeiden mukaisesti, asianmukainen annostelu varmistetaan kuitenkin kemiallisella analyysillä. Tällaisissa tapauksissa eläinten samanaikainen käsittely positiivisella kontrolliaineella ei välttämättä ole tarpeen, ja värjäys- ja pisteytysmenettelyjen valvonta voidaan toteuttaa ottamalla mukaan asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu aiemmin eläimiltä, jotka eivät ole osa tätä koetta. Korkeammilla lajeilla, kuten kädellisillä tai koirilla, tehdyissä tutkimuksissa positiiviset kontrollit voidaan jättää pois edellyttäen, että testauslaboratorio on aiemmin osoittanut hyväksyttävän vasteen käytetyn lajin positiivisille kontrolliaineille. Kaikissa tapauksissa samanaikaiset negatiiviset kontrollit ovat pakollinen osa tutkimusta. Kontrolliryhmien eläimiä on käsiteltävä samalla tavalla kuin hoitoryhmien eläimiä, lukuun ottamatta käsittelyä testiaineella.

Positiivisten kontrollien on tuotettava mikrotumia in vivo altistustasoilla, joiden odotetaan aiheuttavan havaittavissa olevan, tilastollisesti merkitsevän lisäyksen taustaan verrattuna. Positiivisten kontrollien annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät, mutta ne eivät välittömästi paljasta lukijalle koodattujen diojen identiteettiä. On hyväksyttävää, että positiivinen kontrolli annetaan eri reittiä kuin testattava aine ja näytteet otetaan vain kerran. Lisäksi voidaan harkita kemiallista luokkaa vastaavien positiivisten kontrollikemikaalien käyttöä, jos niitä on saatavilla. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista ovat

Negatiiviset kontrollointieläimet, joita on käsitelty pelkällä liuottimella tai kantaja-aineella ja joita on muutoin kohdeltu samalla tavalla kuin hoitoryhmiä, olisi otettava mukaan jokaisella näytteenottokerralla, paitsi että sopivissa olosuhteissa voi olla mahdollista käyttää eläintä omana kontrollinaan vertailemalla hoitoa edeltäviä ja hoidon jälkeisiä näytteitä. Jos negatiivisiin kontrolleihin käytetään yksittäistä näytteenottoa, valittu näytteenottoaika on perusteltava. Lisäksi olisi käytettävä myös käsittelemättömiä kontrolleja, ellei a) testilaboratoriosta ole saatavissa tietoja tai b) historiallisia tai julkaistuja kontrollitietoja, jotka osoittavat, että valittu liuotin/ajoneuvo ei aiheuta haitallisia tai mutageenisia vaikutuksia.

Jos käytetään perifeeristä verta, myös käsittelyä edeltävä näyte voidaan hyväksyä samanaikaiseksi negatiiviseksi kontrolliksi, mutta vain lyhyissä perifeeristä verta koskevissa tutkimuksissa (esim, 1-3 käsittelyä), kun saadut tiedot ovat historiallisen kontrollin odotetulla alueella ja kun liuotinvaikutuksen puuttuminen on osoitettu.

VI. Menettely rotilla ja hiirillä

Seuraavissa kohdissa annetaan ohjeita menettelytavoista hiirillä ja rotilla, jotka ovat tässä määrityksessä yleisimmin käytettyjä lajeja.

A. Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

Kussakin käsitellyssä ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoitavaa eläintä kutakin sukupuolta kohti.(12) Jos tutkimusajankohtana on saatavilla tietoja samoilla lajeilla ja samaa altistumisreittiä käyttäen tehdyistä tutkimuksista, jotka osoittavat, että toksisuudessa ei ole olennaisia eroja sukupuolten välillä, riittää testaaminen yhdellä sukupuolella.

B. Hoitoaikataulu

Voidaan suositella useita erilaisia hoitoaikatauluja (eli 1, 2 tai useampia hoitoja 24 tunnin välein). Näytteet pidennetyistä annosteluohjelmista hyväksytään, kunhan positiivinen vaikutus on osoitettu tässä tutkimuksessa, tai negatiivisessa tutkimuksessa, kunhan toksisuus on osoitettu tai raja-annosta (ks. kohta ”D” jäljempänä) on käytetty ja annostelua on jatkettu näytteenottohetkeen asti. Tämä perustuu tutkimuksiin, jotka osoittavat, että hiirten ja rottien toistuva altistaminen jopa subkroonisen altistuksen keston ajan tuotti samansuuruisia vaikutuksia kuin perinteisellä akuutilla määrityksellä saadut vaikutukset.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Koska on kuitenkin olemassa jonkin verran huolta siitä, että herkkyys saattaa heikentyä pidempikestoisissa tutkimuksissa, koska todellista keskimmäistä enimmäisannospitoisuutta (MTD:tä) ei saavuteta, tai koska sopeutumista voi tapahtua, tällä hetkellä katsotaan, että hoidon kesto olisi rajoitettava neljään viikkoon siihen asti, kunnes määrityksen herkkyys on varmistettu pidempiä hoitoja käytettäessä.(12)

Testiaineet voidaan antaa myös jaettuna annoksena, ts, kaksi tai useampia käsittelyjä samana päivänä enintään muutaman tunnin välein, jotta voidaan helpottaa suuren ainemäärän antamista tai minimoida testiaineen veripitoisuuksien vaihtelut.

Kaksi tapaa, joilla testi voidaan suorittaa, ovat:

• Eläimiä käsitellään testiaineella kerran tai kahdesti enintään 24 tunnin välein. Luuydinnäytteet otetaan vähintään kahdesti 24-48 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta, ja näytteiden välillä on asianmukainen väli. Aiempien kuin 24 tunnin näytteenottoajankohtien käyttö hoidon jälkeen on perusteltava. Perifeerisestä verestä otetaan näytteet vähintään kahdesti 36-72 tunnin kuluttua viimeisestä hoidosta, ja näytteiden välillä on oltava asianmukainen väli. Jos positiivinen vaste todetaan yhdellä näytteenottokerralla, lisänäytteenottoa ei tarvita.
• Jos käytetään kolmea tai useampaa päivittäistä hoitoa (esim. kolme tai useampia hoitoja 24 tunnin välein), näytteet voidaan ottaa luuytimestä kerran viimeistään 24 tunnin kuluttua viimeisestä hoidosta ja perifeerisestä verestä kerran viimeistään 40 tunnin kuluttua viimeisestä hoidosta.

Lisäaikoja näytteenottoon voidaan käyttää, jos se on tarkoituksenmukaista ja tieteellisesti perusteltua.

C. Annostasot

Jos tehdään annosalueen määritystutkimus, koska sopivia tietoja ei ole saatavilla, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, kantaa, sukupuolta ja hoito-ohjelmaa, jota käytetään päätutkimuksessa.(7) Jos toksisuutta esiintyy, ensimmäisellä näytteenottokerralla on käytettävä kolmea annostasoa. Näiden annostasojen olisi katettava vaihteluväli selvästä toksisuudesta vähäiseen tai ei lainkaan toksisuuteen. Myöhemmällä näytteenottokerralla on käytettävä vain suurinta annosta. Suurimmalla annoksella tarkoitetaan annosta, joka aiheuttaa sellaisia myrkyllisyyden merkkejä, että samalla annosteluohjelmalla annettujen suurempien annostasojen odotetaan aiheuttavan kuolemaan johtavan. Aineet, joilla on erityisiä biologisia vaikutuksia pienillä myrkyttömillä annoksilla (kuten hormonit ja mitogeenit), voivat olla poikkeuksia annoksen määrittämiskriteereihin, ja ne olisi arvioitava tapauskohtaisesti. Suurimmaksi annokseksi voidaan määritellä myös annos, joka aiheuttaa jonkin merkin luuytimen toksisuudesta (esim. epäkypsien erytrosyyttien osuuden väheneminen kaikista erytrosyytteistä luuytimessä tai perifeerisessä veressä).

D. Raja-arvotesti

Jos havaittavia myrkyllisiä vaikutuksia ei synny yhdellä annostasolla vähintään 2000 mg/kg ruumiinpainoa tai kahdella hoidolla samana päivänä ja jos genotoksisuutta ei ole odotettavissa rakenteellisesti samankaltaisista aineista saatujen tietojen perusteella, täysi tutkimus, jossa käytetään kolmea annostasoa, ei ehkä ole tarpeen. Pidempikestoisissa tutkimuksissa raja-annos on 2000 mg/kg/ruumiinpaino/vrk enintään 14 päivän hoidossa ja 1000 mg/kg/ruumiinpaino/vrk yli 14 päivän hoidossa. Ihmisen odotettavissa oleva altistuminen voi osoittaa, että raja-arvotestissä on käytettävä suurempaa annostasoa.

E. Annosten antaminen

Testattava aine annetaan yleensä nieltynä mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin avulla tai vatsansisäisenä injektiona. Muut altistusreitit voivat olla hyväksyttäviä, jos ne voidaan perustella. Suurin nestemäärä, joka voidaan antaa kerralla ruokintana tai injektiona, riippuu koe-eläimen koosta. Tilavuus ei saa ylittää 2 ml/100 g ruumiinpainoa. Tätä suurempien tilavuuksien käyttö on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suuremmilla pitoisuuksilla, testitilavuuden vaihtelu on minimoitava säätämällä pitoisuutta siten, että tilavuus pysyy vakiona kaikilla annostasoilla.

F. Luuytimen/veren valmistelu

Luuydinsolut saadaan tavallisesti reisiluun tai sääriluun soluista välittömästi uhrauksen jälkeen. Tavallisesti solut poistetaan reisiluun tai sääriluun luista, valmistetaan ja värjätään vakiintuneita menetelmiä käyttäen. Perifeerinen veri saadaan häntälaskimosta tai muusta sopivasta verisuonesta. Verisolut värjätään välittömästi supravitaalisesti(4),(5),(14) tai niistä tehdään preparaatit, jotka sitten värjätään. DNA-spesifisen värjäyksen (esim. akridiinioranssi(15) tai Hoechst 33258 plus pyroniini-Y(30)) käyttö voi poistaa osan artefakteista, jotka liittyvät muiden kuin DNA-spesifisten värjäysten käyttöön. Tämä etu ei sulje pois tavanomaisten värjäysten (esim. Giemsa) käyttöä. Muita järjestelmiä (esim, selluloosapylväät nukleoituneiden solujen poistamiseksi(36)) voidaan myös käyttää edellyttäen, että näiden järjestelmien on osoitettu toimivan asianmukaisesti mikrotumakkeiden valmistuksessa laboratoriossa.

G. Analyysi

Epäkypsien osuus kaikista (epäkypsistä + kypsistä) erytrosyyteistä määritetään kullekin eläimelle laskemalla yhteensä vähintään 200 erytrosyyttiä luuytimestä ja 1000 erytrosyyttiä perifeerisestä verestä.(9) Kaikki objektilasit, mukaan lukien positiivisten ja negatiivisten kontrollien objektilasit, on koodattava toisistaan riippumatta ennen mikroskooppista analysointia. Vähintään 2000 epäkypsää erytrosyyttiä eläintä kohti pisteytetään mikrotumallisten epäkypsien erytrosyyttien esiintyvyyden määrittämiseksi. Lisätietoa voidaan saada pisteyttämällä kypsät erytrosyytit mikrotumien varalta. Dioja analysoitaessa epäkypsien erytrosyyttien osuuden kaikista erytrosyyteistä on oltava vähintään 20 % kontrolliarvosta. Kun eläimiä hoidetaan yhtäjaksoisesti vähintään 4 viikon ajan, vähintään 2000 kypsää erytrosyyttiä eläintä kohti voidaan myös pisteyttää mikrotumien esiintymisen osalta. Automaattiset analyysijärjestelmät (kuva-analyysi tai solususpensioiden virtaussytometrinen analyysi) ovat hyväksyttäviä vaihtoehtoja manuaaliselle arvioinnille, jos ne on asianmukaisesti perusteltu ja validoitu suhteessa klassiseen mikroskooppiseen pisteytykseen.(12)

VII. Menettely muille lajeille kuin rotille ja hiirille

Julkaistua tietoa, joka perustuu hiirillä, rotilla, hamstereilla, sioilla, koirilla, kädellisillä ja ihmisillä tehtyihin tutkimuksiin(3),(6),(18),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(28),(31),(31),(31),(45) osoittavat, että mikrotumallisten erytrosyyttien spontaanit ja indusoidut frekvenssit ovat samankaltaisia useimmilla nisäkäslajeilla, ja viittaavat siihen, että mikrotumallisten epäkypsien erytrosyyttien esiintyvyyden mittaaminen luuytimessä soveltuu kromosomi- tai spindelivaurion arviointiin näissä tähän mennessä tutkituissa lajeissa. Mikronukleoituneiden erytrosyyttien ilmaantuminen ja häviäminen luuytimestä riippuu kunkin lajin erytrogeneesin kinetiikasta ja erytrosyyttien eliniästä, minkä vuoksi annostelu- ja näytteenotto-ohjelmia on muutettava kunkin lajin erytrosyyttien kinetiikan asianmukaisten parametrien mukaisesti. Tarvittaessa voidaan käyttää muitakin lajeja kuin hiiriä tai rottia, mutta seuraavat tiedot on sisällytettävä:

• Valittujen lajien sekä käytettyjen annostelu- ja näytteenottosuunnitelmien perustelut suhteessa erytropoieesin kinetiikkaan ja erytrosyyttien elinikään käytetyissä lajeissa;
• Todisteet siitä, että spontaanien mikrotumien esiintymistiheys on yhdenmukainen julkaistujen tietojen kanssa ja/tai johdonmukainen tutkimusta tekevässä laboratoriossa;
• Todisteet siitä, että tunnetut genotoksiset aineet aiheuttavat käytetyissä lajeissa mikrotumien esiintymistiheyden lisääntymisen, ja viitearvot aiheutetun vasteen suuruudelle;
• Mikrotumien valikoivan poiston vaikutus pernan kautta perifeerisestä verestä (kun perifeerinen veri toimii seurattavana kudoksena).

VIII. Tiedot ja raportointi

A. Hoitotulokset

Yksittäisten eläinten tiedot on esitettävä taulukkomuodossa. Koeyksikkö on eläin. Pisteytettyjen epäkypsien erytrosyyttien lukumäärä, mikronukleoituneiden epäkypsien erytrosyyttien lukumäärä ja epäkypsien erytrosyyttien lukumäärä kaikista erytrosyytteistä on lueteltava erikseen kustakin analysoidusta eläimestä. Jos eläimiä hoidetaan yhtäjaksoisesti vähintään 4 viikon ajan, myös kypsiä erytrosyyttejä koskevat tiedot on ilmoitettava, jos niitä on kerätty. Kustakin eläimestä on ilmoitettava epäkypsien erytrosyyttien osuus kaikista erytrosyyteistä ja tarvittaessa mikrotumallisten kypsien erytrosyyttien prosenttiosuus. Jos ei ole näyttöä sukupuolten välisestä erosta vasteessa, molempien sukupuolten tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysia varten.

B. Tulosten arviointi ja tulkinta

Positiivisen tuloksen määrittämiseksi on olemassa useita kriteerejä, kuten annoksesta riippuvainen mikronukleoituneiden solujen lukumäärän lisääntyminen tai mikronukleoituneiden solujen lukumäärän selvä lisääntyminen yksittäisessä annosryhmässä yhdellä näytteenottoajankohdalla. Testitulosten arvioinnissa on käytettävä tilastollisia menetelmiä.(24),(35) Positiivisen, negatiivisen tai epäselvän tuloksen tilastolliset kriteerit on ilmoitettava selkeästi tutkimussuunnitelmassa. Koska biologiset tekijät voivat muuttaa tulkintaa, tilastollinen merkitsevyys ei saisi olla ainoa ratkaiseva tekijä johtopäätöksen tekemisessä. Epäselvät tulokset olisi selvitettävä jatkokokeilla ja tarvittaessa muuttamalla koeolosuhteita.

Vaikka useimmat kokeet antavat selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, harvoissa tapauksissa aineisto estää lopullisen arvion tekemisen testattavan aineen aktiivisuudesta. Tulokset voivat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi riippumatta siitä, kuinka monta kertaa koe toistetaan.

Positiiviset tulokset mikrotumakokeessa osoittavat, että aine aiheuttaa mikrotumia, jotka ovat seurausta kromosomivauriosta tai mitoosilaitteen vaurioitumisesta testattavan lajin erytroblasteissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiolosuhteissa testattava aine ei aiheuta kromosomi- tai spindelivaurioita, jotka johtavat mikrotumien muodostumiseen testattavan lajin epäkypsissä erytrosyyteissä.

Keskusteltava todennäköisyydestä, että testattava aine tai sen aineenvaihduntatuotteet pääsevät yleiseen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen (esim. systeeminen toksisuus). Riittävän kohdekudosaltistuksen osoittaminen negatiivisessa mikrotumakokeessa on erityisen tärkeä näkökohta silloin, kun genotoksisuudesta on positiivista näyttöä yhdessä tai useammassa muussa testausjärjestelmässä.

C. Testiraportti

Testiraportin tulee sisältää myös seuraavat tiedot:

1. Testiaine

• identifiointitiedot ja CAS-numero
  • , jos tiedossa
  • fysikaalinen luonne ja puhtaus
  • fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, joilla on merkitystä tutkimuksen suorittamisen kannalta
  • testiaineen stabiilisuus, jos tiedossa

  2. Liuotin/kantaja-aine

  • perusteet kantaja-aineen valinnalle
  • testattavan aineen liukoisuus ja stabiilisuus liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa

  3. Annostusliuokset

  • annostusliuosten valmistus- ja käyttöajankohdat (tai valmistuksen ja käytön välinen aika) ja säilytysolosuhteet
  • tiedot, jotka varmentavat annostusliuoksen konsentraation, jos saatavilla

  4. Koe-eläimet

  • käytetty laji/kanta, mukaan lukien perustelut
  • eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli
  • lähde, pito-olosuhteet, ruokavalio jne.
  • eläinten yksilöllinen paino kokeen alussa, mukaan lukien ruumiinpainon vaihteluväli, kunkin ryhmän keskiarvo ja keskihajonta
  • tiedot pernan valinnan mahdollisesta vaikutuksesta mikronukleoituneiden solujen esiintyvyyteen perifeerisessä veressä, tarvittaessa

  5. Testiolosuhteet

  • positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot
  • tiedot vaihteluvälitutkimuksesta, jos tehty
  • annostason valinnan perusteet
  • testattavan aineen valmistuksen yksityiskohdat
  • testattavan aineen antamisen yksityiskohdat
  • annostelureitin ja annosteluohjelman perusteet
  • menetelmät sen todentamiseksi, että testattava aine on päässyt yleiseen verenkiertoon ja/tai kohdekudokseen, tarvittaessa
  • muunnos ruokavalion/juomaveden testiainepitoisuudesta (ppm) todelliseksi annokseksi (mg/kg ruumiinpainoa/vrk), tarvittaessa
  • tarkat tiedot elintarvikkeiden ja veden laadusta
  • tarkka kuvaus käsittely- ja näytteenottosuunnitelmista
  • lidien valmistusmenetelmät
  • myrkyllisyyden mittausmenetelmät
  • kriteerit mikronukleoituneiden epäkypsien erytrosyyttien pisteyttämistä varten ja, tarvittaessa ja soveltuvin osin kypsät erytrosyytit
  • analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti
  • kriteerit, joiden perusteella tutkimukset katsotaan positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi

  6. Tulokset

  • toksisuuden merkit
  • kypsymättömien erytrosyyttien osuus kaikista erytrosyytteistä
  • mikroytimettömien kypsymättömien erytrosyyttien määrä kaikista kypsymättömistä erytrosyytteistä, erikseen kunkin eläimen osalta
  • mikäli se on tarkoituksenmukaista ja tarkoituksenmukaista, kypsien kypsien erytrosyyttien mikroytimettömien määrä kaikista kypsien erytrosyyttien määrästä, erikseen kustakin eläimestä
  • keskiarvo ± keskihajonta mikrotumallisten epäkypsien ja tarvittaessa kypsien erytrosyyttien määrässä ryhmää kohti
  • annos-vastesuhde, jos mahdollista
  • tilastolliset analyysit ja perustelut käytetylle menetelmälle, asianmukaiset kirjallisuusviittaukset
  • yhtäaikaiset ja aiemmat negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot
  • yhtäaikaiset ja aiemmat positiivisia kontrolleja koskevat tiedot

  7. Tulosten käsittely

  8. Johtopäätökset

  XI. Lisäys: Aksentrisista fragmenteista vs. sentromeerisistä kromosomeista peräisin olevien mikrotumien tunnistaminen

  Mikrotumat voivat muodostua akentrisista fragmenteista tai mitoosissa jäljelle jäävistä kokonaisista kromosomeista. Nämä jälkimmäiset mikrotumat tunnistettiin aluksi niiden suuren koon perusteella(49) C-nauhoituksella(47) tai DNA-pitoisuuden mittaamisella(46) . Nämä menetelmät eivät kuitenkaan olleet kovin luotettavia. Sen vuoksi kehitettiin kaksi molekyylisytogeneettistä menetelmää, joilla tunnistettiin sentromeerien esiintyminen mikrotumakkeissa ja siten eroteltiin toisistaan klastogeenisen ja aneugeenisen alkuperän omaavat mikrotumat:(12) 1) immunofluoresoiva CREST-värjäys ja 2) fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH), jossa käytettiin pansentromerisia DNA-koettimia. Kun on mekanistisesti tärkeää määrittää kinetokorin tai sentromeerin läsnäolo mikrotumakkeissa, näitä menetelmiä voidaan soveltaa.

  Luuydinmikrotumakokeeseen sovellettua CREST-menetelmää kuvaavat yksityiskohtaisesti Miller ja Adler.

  Luuydinmikrotumakokeeseen sovellettua CREST-menetelmää kuvaavat yksityiskohtaisesti Miller ja Adler.

  Luuydinmikrotumakokeeseen sovellettua CREST-menetelmää kuvaavat yksityiskohtaisesti Miller ja Adler.

  (33) Dioleilla (normaaleissa luuydinmaljoissa) olevat solut fiksoidaan, dehydratisoidaan ja inkuboidaan kahdessa vaiheessa SDS:llä sekä triton-X:lla, minkä jälkeen solut värjäytyvät vasta-aineen kanssa. DNA vastavärjätään Hoechst 33258:lla.

  FISH:ssä käytetään sentromeerin lähellä hybridisoituvaa minor satellite DNA-koetinta(43) sentromeerisen alueen tunnistamiseen, jos sellainen on olemassa. Pinkel et al.(34) ovat kuvanneet FISH-menetelmän, jossa käytetään sentromeerisiä DNA-koettimia.(10) Menetelmää voidaan soveltaa virtauslajiteltuihin mikrotumakkeita sisältäviin erytrosyytteihin(34) tai perifeerisistä verinäytteistä saatuihin eristettyihin mikrotumakkeisiin.(13)

  Kontrollidioissa sentromeerisen alueen sisältävien leimattujen mikrotumien osuus on noin 50 %.(43) Tunnettujen aneugeenien (kolkisiini ja vinblastiini) indusoimista mikrotumista noin 70 % on leimattuja,(33) kun taas klastogeeneillä (hydrokinoni ja mitomysiini C) indusoiduista mikrotumista vain 5-15 % on leimattuja mikrotumia.(33) Kemikaalin suhteellisen klastogeenisen vs. aneugeenisen aktiivisuuden luonnehtimiseksi on hyödyllistä käyttää indeksinä mikrotumallisten polykromaattisten erytrosyyttien lukumäärää 1000:aa sentromeerisen alueen sisältävää polykromaattista erytrosyyttiä kohti.(42)

  Tähän mennessä kuvattujen FISH-menetelmien tärkein puute on se, että ne eivät tee eroa normokromaattisten ja polykromaattisten erytrosyyttien välillä.(12) Näin ollen analyysiin soveltuvat ainoastaan valmisteet, joissa suuri osa esiintyvistä mikrotumakkeista on testituotteen indusoimia. Esimerkiksi perifeeriset verinäytteet, jotka on otettu kokeista, joissa aikuisilla eläimillä on akuutti altistus, eivät periaatteessa koskaan sovellu analysoitaviksi, koska kohdesolupopulaatio (epäkypsät erytrosyytit) on vain 3-5 prosenttia näytteen erytrosyyteistä.

  Johtopäätöksenä voidaan todeta, että CREST- tai FISH-merkintää pidetään luotettavina menetelminä kemikaalien aneugeenisten ominaisuuksien havaitsemiseksi in vivo -mikronukleusmäärityksessä edellyttäen, että kiinnitetään huomiota sen varmistamiseen, että analyysiin käytetään sopivia näytteitä. 12 Nykyisten menetelmien monimutkaisuus rajoittaa kuitenkin niiden käytön niihin tapauksiin, joissa kemikaalin epäillään aiheuttavan spindle-häiriöitä (esim, suurten mikrotumien esiintymisen, polyploidian indusoitumisen jne. vuoksi) tai kun on muita erityisiä syitä saada tätä mekanistista tietoa.

  X. Viitteet

  1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
  2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Bentseenin aiheuttama mikrotumien induktio B6C3F1-hiirissä: Retrospektiivinen analyysi perifeerisen veren näytteistä NTP Carcinogenesis Bioassay -testistä. Mutation Res. 143:55-59.
  3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. ja Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
  4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
  5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Lyhytaikaista hiiren perifeerisen veren mikronukleustestiä varten suositeltu protokolla (Protocol Recommended for the Short-Term Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test). Mutagenesis 10:153-159.
  6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. ja MacGregor, J.T. (1988). Marginaalisen folaattivajeen yhteys lisääntyneisiin ihmisen kromosomivaurioihin in vivo: osoitus mikronukleoituneiden erytrosyyttien analyysillä. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
  7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. ja Richold, M. (1992). British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society -työryhmän raportti: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
  8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). In vivo rotan mikronukleustesti: integrointi 14 päivän tutkimukseen. Mutation Res. 342:71-6.
  9. Gollapudi, B. ja McFadden, L.G. (1995). Näytekoko polykromaattisten ja normokromaattisten erytrosyyttien suhdeluvun arvioimiseksi luuytimen mikronukleustestissä. Mutation Res. 347:97-99).
  10. Grawé J., Nüsse M. ja Adler I.-D. (engl.). (1997). Hiiren erytrosyyttien mikronukleusinduktion kvantitatiiviset ja kvalitatiiviset tutkimukset virtaussytometriaa käyttäen: I. Perifeerisen veren polykromaattisten erytrosyyttien mikronukleusinduktion mittaaminen tunnetusti ja epäiltyä genotoksisuutta aiheuttavien kemikaalien vaikutuksesta. Mutagenesis 12:1-8.
  11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Jyrsijöiden pitkäaikaisen mikrotumakokeen arviointi: Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
  12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. ja Sutou, S. (2000). Jyrsijöiden erytrosyyttien mikronukleusmääritys in vivo: II. Joitakin protokollan suunnitteluun liittyviä näkökohtia, mukaan lukien toistuvat käsittelyt, integrointi myrkyllisyystesteihin ja automatisoitu pisteytys. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
  13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Mikrotumien eristäminen hiiren verestä, fluoresenssi-in-situ-hybridisaatio hiiren sentromeerisellä DNA-koettimella. Mutation Res. 307:245-251.
  14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1990). Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides (Mikrotumakokeet hiiren perifeerisen veren retikulosyyteillä käyttäen akridiinioranssilla päällystettyjä objektiolevyjä). Mutation Research 245:245-249.
  15. Hayashi, M., Sofuni, T., ja Ishidate, M. Jr. (1983). Akridiinioranssin fluoresoivan värjäyksen soveltaminen mikrotumakokeeseen. Mutation Res. 120:241-247.
  16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. ja Vannier, B. (1994). Jyrsijöiden erytrosyyttien mikronukleusmääritys in vivo. Mutation Res. 312:293-304.
  17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
  18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. ja Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123:61-118.
  19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induction of Micronuclei in Rat Bone Marrow and Peripheral Blood Following Acute and Subchronic Treatment with Azathioprine. Mutation Res. 291:79-85.
  20. Higashikuni, N. ja Sutou, S. (1995). Optimaalinen, yleistetty näytteenottoaika 30 ±6 h kaksinkertaisen annostelun jälkeen hiiren perifeerisen veren mikronukleuskokeessa. Mutagenesis 10:313-319.
  21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadieeni: B6C3F1-hiirten perifeerisen veren mikrotumallisten erytrosyyttien indusoituminen hengittämällä 13 viikon ajan. Mutation Res. 209:171-176.
  22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Mikrotumien arvioinnin validointi rotalla käyttäen virtaussytometriaa viidellä malliyhdisteellä. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
  23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation into Routine Toxicology Studies: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
  24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. ja Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (toim.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney s. 184-232.
  25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). Altistusohjelman ja altistuksen keston vaikutus bentseenin aiheuttamiin luun- ja marrasvaurioihin hiirillä (The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice). I. Sukupuolivertailu DBA/2-hiirillä. Mutation Res. 203:251-271.
  26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. ja Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
  27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N. ja Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: ”Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell ja T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, s. 555-558.
  28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. ja Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
  29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. ja Shelby, M.E. (1990). In vivo erytrosyyttien mikronukleustesti: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies (Myrkyllisyystutkimukset: mittaus vakaassa tilassa lisää määrityksen tehokkuutta ja mahdollistaa integroinnin toksisuustutkimuksiin). Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
  30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. ja Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
  31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimon-Induced Chromosomal Damage in Bone Marrow Cells of Six Mammalian Species. Mutation Res. 12:417-425.
  32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. ja Heddle, J.A. (1990). In vivo -mikronukleusmääritys nisäkkäiden luuytimessä ja perifeerisessä veressä. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
  33. Miller B.M. ja Adler I.-D. (2002). (1990). Antikinetokori-vasta-ainevärjäyksen (CREST-värjäys) soveltaminen in vivo indusoitujen erytrosyyttien mikrotumiin. Mutagenesis 5:411-415.
  34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Sytogeneettinen analyysi käyttäen kvantitatiivista, korkean herkkyyden fluoresenssihybridisaatiota. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
  35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. ja Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (toim.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Raportti. Osa I tarkistettu. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.
  36. Romagna, F. ja Staniforth , C.D.(1989). Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
  37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Rapid Screen for Cumulative Chromosomal Damage in Mice. Accumulation of Circulating Micronucleated Erythrocytes. Mutation Res. 113:481-487.
  38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Kroonisen kromosomirikkoutumisen havaitseminen hiirillä. Mutatation Res. 104:367-369.
  39. Schlegel, R. ja MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats: Implications for Cytogenetic Screening. Mutation Res. 127:169-174.
  40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. ja Everson, R.B. (1986). Assessment of Cytogenetic Damage by Quantitation of Micronuclei in Human Peripheral Blood Erythrocytes. Cancer Res. 46:3717-3721.
  41. Schmid, W. (1975). Mikrotumakoe. Mutation Res. 31:9-15.
  42. Schriever-Schwemmer G. and Adler I.-D. (1997). Mikrotumien erilaistuminen hiiren luuydinsoluissa: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
  43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U. ja Adler I.-D. (suom.). (1994). Kolkisiinin tai akryyliamidin indusoimat ekstrudoituneet mikrotumat sisältävät enimmäkseen jäljelle jääviä kromosomeja, jotka on tunnistettu Paintbrush-levyissä hiiren DNA-koettimien Minor ja Major avulla. Mutagenesis 12:201-207.
  44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Mikrotumallisten erytrosyyttien ja DNA-vaurioiden mittaaminen fenoliftaleiinin kroonisen nauttimisen aikana p53-geenin suhteen heterotsygoottisilla siirtogeenisillä naarashiirillä. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
  45. Tsuchimoto, T. ja Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
  46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L. ja Kirsch-Volders M. (1989). Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
  47. Verschaeve L., Vanderkerken K. ja Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
  48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Fenolftaleiini: Micronucleated Erythrocytes induction in Mice. Mutation Res. 341:151-60.
  49. Yamamoto K.I. ja Kikuchi Y. (1980). A Comparison of Diameters of Micronuclei Induced by Clastogens and by Spindle Poisons. Mutation Res. 71:127-131.
  50. Yamamoto K.I. ja Kikuchi Y. (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.